L’ANALYSE DES BIOTOXINES MARINES ET PREUVE DE CONCEPT

Introduction

L’utilisation de la spectrométrie de masse haute résolution pour le criblage non ciblé employant les approches dites « métabolomiques » a connu un essor considérable ces dernières années dans de nombreux domaines notamment en analyse environnementale. Plusieurs travaux sont désormais focalisés sur l’amélioration des connaissances pour la mise en œuvre de cette technique afin d’identifier de nouvelles molécules d’intérêts. Cependant l’apport de ce type d’approche n’a pas encore été suffisamment étudié dans le domaine des biotoxines marines. Nous présenterons ici notre démarche et les résultats que nous avons obtenus dans le cadre d’expériences de preuve de concept visant à démontrer le potentiel et les limites des analyses globales selon une approche non ciblée par spectrométrie de masse à haute résolution pour une caractérisation plus fine et plus complète d’échantillons contaminés et l’identification potentielle de composés émergents. Nous détaillerons dans ce chapitre la démarche entreprise pour l’approche de suspect screening et l’analyse sans a priori. Pour cette dernière, nous mettons l’accent sur les étapes de traitement de données réalisées avec deux logiciels constructeurs (MasterviewTM et MarkerView) et le logiciel open source XCMS disponible sous la plateforme «Workflowformetabolomics». B. Traitement des données HRMS avec les logiciels constructeurs I. Matériels et Méthodes I.1. Produits chimiques et réactifs Les produits et réactifs chimiques utilisés pour les expériences décrites dans ce chapitre sont les mêmes que ceux présentés dans le chapitre II.B (I.1). La solution étalon de boscalid (à 10 ng/µL dans l’ACN) utilisée comme étalon interne a été achetée auprès du fournisseur Dr Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Allemagne)

Préparation des échantillons et des solutions de travail

 Dans le cadre de notre preuve de concept, nous avons choisi de réaliser notre étude sur des échantillons de moules et d’huîtres contrôle que nous avons supplémentés avec des toxines connues dont les étalons sont commercialisés. Les expériences de supplémentation étant très coûteuses, nous avons fait le compromis de sélectionner quelques toxines de familles différentes ; 5 toxines analysables en ESI+ (GYM, SPX1, AZA1, PnTXA, PTX2) et 4 toxines analysables en ESI-. (AO, DTX1, DTX2, AD). Les échantillons contrôles de moules et d’huîtres ont été extraits selon le mode opératoire standard de l’EURLMB décrit dans le chapitre II.B (I.4). Un contrôle réactif a été également préparé selon le même protocole. Les extraits de moules et d’huîtres ont ensuite été supplémentés par les toxines choisies. Les solutions d’ajouts ont été préparées à différents niveaux de concentrations à partir d’une solution mère multitoxines (240 ng/mL) tel que décrit dans les Tableau 22 et Tableau 23 Ne disposant pas de standard interne spécifique aux biotoxines marines, une solution étalon de boscalid (10 ng/mL) a été ajoutée aux solutions de supplémentation comme composé de référence dans le cadre des analyses sans a priori.

Acquisition et traitement des données 

L’acquisition des données a été réalisée par le logiciel Analyst® TF 1.7.1 (Sciex, Toronto, ON, Canada). Pour l’approche suspect screening, les logiciels PeakView® (Sciex, Toronto, ON, Canada) et son algorithme MasterViewTM (Sciex, Toronto, ON, Canada) ont été utilisés pour visualiser et traiter les données. Une liste de composés suspects a été créée avec MasterViewTM avec 821 molécules incluant biotoxines marines et cyanotoxines. Les seules informations disponibles dans cette liste de suspects sont les noms des molécules, leurs formules brutes et leurs masses exactes. La liste a été utilisée pour les deux modes d’ionisation pour chercher les ions [M+H]+ et [M-H]- en ESI+ et ESI- respectivement. Après le traitement, le logiciel permet d’afficher les résultats dans le volet chromatogramme et dans un tableau. Ce tableau affiche des informations pour l’identification des composés en fonction des résultats de recherche de la bibliothèque créée, y compris le temps de rétention, l’erreur de masse (ppm ou Da), la composition élémentaire et le score de pureté. Des paramètres de confiance pour l’identification des composés sont définis avant de procéder au traitement des données permettant de filtrer les ions détectés selon un code tricolore (vert, orange et rouge) en fonction du niveau de confiance (Figure 31). Pour l’approche « suspect screening » nous nous sommes intéressés uniquement à l’erreur de masse, le ratio isotopique et le Formula Finder Score. Les composés répondant aux critères fixés sont affichés en vert en haut du tableau et sont considérés comme des potentiels positifs. Cette identification automatique est un premier filtre qui permet de réduire la liste et de prioriser les ions à étudier. Ensuite pour chaque composé de la liste, nous vérifions l’allure du pic correspondant, le rapport S/N, la cohérence du temps de rétention, le profil isotopique et pour confirmation le spectre de fragmentation MS/MS. Les deux logiciels d’extraction de pics MasterViewTM et MarkerViewTM ont été testés pour l’approche non-ciblée sans a priori : o Le logiciel MasterViewTM possède un algorithme d’extraction de pics non ciblé « untargeted peak finding » qui permet l’extraction des pics d’intérêt à partir des données brutes. L’extraction des pics a été réalisée en fixant certains paramètres au préalable (Figure 32)