Extraction ADN

Tous les ADN extraits sont conservés à -25°C. 1 / Extraction ADN de la tumeur L’ADN des échantillons inclus en paraffine (FFPE) est extrait avec le kit QIAamp® DNA FFPE Kit, référence 56404, selon les recommandations du fournisseur (QIAGEN, Les Ulis, France). Elution dans 100µl de tampon d’élution.

 Extraction ADN du plasma

• Technique manuelle, technologie sur colonne avec une membrane à base de silice: QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit, référence 55114. Extraction selon les recommandations du fournisseur (QIAGEN, Les Ulis, France), à partir de 2 ou 3 mL de plasma, élution dans 50µl de tampon d’élution. • Technique manuelle, technologie de bille paramagnétique : MagMAX™ Cell Free DNA Isolation Kit référence A29319. Protocole selon les recommandations du fournisseur (Life Technologies – Thermo Fisher Scientific), extraction à partir de 1mL de plasma, élution dans 50µl ou 15µl de tampon d’élution. • Technique sur automate QIAsymphony® SP de la société QIAGEN. Technologie de bille paramagnétique: kit DSP Virus Pathogen (QIAGEN, référence 937055), l’extraction se fait sur 2mL de plasma et élution dans 40µl de tampon AVE, selon les recommandations du fournisseur (QIAGEN, Les Ulis, France). • Technique sur automate Maxwell® RSC de Promega. Technologie de purification sur bille paramagnétique : kit Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit, référence AS1480. Extraction sur 1 mL de plasma, élution dans 60µl de tampon TE, selon les recommandations du fournisseur (Promega, Charbonnières-les-Bains, France).

 Extraction ADN des lignées cellulaire

L’ADN des lignées cellulaires, contenant au moins 3 millions de cellules, est extrait avec le kit QIAamp® DNA Mini Kit référence 51306, selon les recommandations du fournisseur (QIAGEN, Les Ulis, France). L’élution se fait dans 200µl de tampon d’élution. 4 / Extraction ADN de la couche leucocytaire du prélèvement sanguin L’ADN de buffy coat est extrait avec le kit QIAamp® DNA Mini Kit référence 51306, selon les recommandations du fournisseur (QIAGEN, Les Ulis, France). L’élution se fait dans 200µl de tampon d’élution. III / Quantification de l’ADN L’ADN est quantifié avec un Qubit® 2.0 fluorometer (invitrogen™-ThermoFisher Scientific, Saint Aubin, France) et le kit Qubit® dsDNA HS Assay Kit référence Q32854 pour l’ADNlc et le kit Qubit® dsDNA BR Assay kit, référence Q32853 pour les ADN non issus de plasma. IV / Fragmentation de l’ADN L’ADN génomique et les ADN de lignée cellulaire contrôles, sont fragmentés avec un sonicateur S220 Focused-Ultrasonicator (Covaris, Woburn, MA) à une taille de 600-800 paires de base. La taille des fragments est vérifiée par LabChip® GX/GXII Microfluidic system avec le kit DNA Assay 5k reagent Kit (Perkin-Elmer, Villebon-sur-Yvette, France). V / ADN contrôle • ADN génomique non muté, (Promega, Charbonnières-les-Bains, France, référence G3041). • Les lignées cellulaires servant de contrôle pour les tests en digitale PCR proviennent toutes de l’ATCC (Manassas, VA 20110, US). 51 • Les lignées avec une mutation EGFR : H1975 (p.T790M et p.L858R), H1650 (delE746-A750) ; avec une mutation KRAS A427 (p.G12D), H358 (p.G12C), SW620 (p.G12V), avec une mutation BRAF HT-29 (p.V600E). • Pour valider la sonde EGFR p.L861Q, nous utilisons un ADN issu d’un échantillon de patient avec un cancer du poumon métastatique (Hôpital Européen George Pompidou, Paris, France). • Pour valider la sonde KRAS p.G12R, nous utilisons un ADN issu d’une lignée cellulaire immortalisée (construction par mutagenèse dirigée (collaboration avec le Pr Pagès CHU de Tours)). • Témoins ADN FFPE multiplex (muté BRAF, KIT, EGFR, KRAS, NRAS, PIK3CA) référence HD-200, ADN génomique avec 10 mutations à une fréquence allélique de 5% (BRAF, EGFR, FLT3, IDH1, JAK2, KRAS, MEK, NOTCH1, NRAS, PIK3CA) référence HD-728, de la société Horizon Diagnostics™ – Royaume Uni) Liste des ADN contrôle en Annexe 1. VI / Digitale PCR : technique de PCR en microgouttelettes Principe Une molécule d’ADN est isolée dans une goutte dans laquelle se trouve l’ensemble des réactifs nécessaires à sa réplication. Chaque molécule d’ADN présente dans l’échantillon sera amplifiée de façon uniforme. La réplication de l’ADN sera représentative de l’échantillon de départ (respect des proportions sauvage / mutant). Dans chacune des gouttes, la réaction de PCR permet simultanément d’amplifier un fragment d’ADN, et d’amplifier le signal lumineux (fluorescence) émis par la dégradation de sondes TaqMan® spécifiques. S’en suit une lecture du signal lumineux de chacune des gouttes permettant de réaliser la détection et la quantification absolue du nombre de copies mutées. Le nombre de goutte donne la quantité amplifiable d’ADN cible. Les résultats sont présentés selon un diagramme en 2 dimensions où chaque point représente l’intensité fluorescente d’une goutte.