Analyse avec le logiciel ImageJ d’un lot d’images en microscopie par immunofluorecence de cellules de fibroblastes irradiées en X à l’E.S.R.F

Le problème de radiosensibilité individuelle est plus d’actualité que jamais face à l’apparition d’une diversification des types de faisceaux et notamment l’apparition des faisceaux de particules lourdes (hadronthérapie par ions légers tels les ions carbone) pour le traitement de tumeurs cancéreuses radio-résistantes aux traitements classiques par photons. C’est dans ce cadre que le programme de recherche expérimentale ROSIRIS (RadiobiOlogie des Systèmes Intégrés pour l’optimisation des traitements utilisant des rayonnements ionisants et évaluation du RISque associé) a été initié par l’IRSN et l’INSERM. Un des objectifs de ce programme scientifique est de corréler les observables caractérisant les événements biologiques précoces aux événements physiques résultant des dépôts d’énergie des rayonnements ionisants dans les cellules. L’originalité de l’approche réside dans l’utilisation des techniques les plus récentes d’identification des cassures double-brin de l’ADN. La méthode choisie pour l’étude des cassures doubles brins est l’observation des foci H2AX en microscopie par immunofluorescence. L’immunofluorescence avec des anticorps spécifiques contre les formes phosphorylées de l’histone H2AX (  -H2AX) permet en effet de mettre en évidence les cassures susceptible de changer. Le projet ROSIRIS a pour objectif de constituer des plateformes d’irradiation, ainsi qu’une plateforme de traitement et des analyses des images cellulaires, basée sur l’utilisation d’un microscope automatisée. Cette plateforme devrait permettre de traiter une grande quantité d’images et donc de constituer une base de données significatives permettant de tester les observables biologiques en fonctions des conditions d’irradiation. Parallèlement à ce dispositif expérimental d’acquisition d’image, il sera nécessaire de mettre au point un logiciel de traitement et d’analyse le plus indépendant possible de l’opérateur permettant une analyse automatique des données. Cette note décrit les résultats d’une première approche de ce domaine, destiné à en préciser les difficultés et les défis pour obtenir et réaliser une telle plateforme d’analyse d’image.

Les individus présentent de façon innée une sensibilité variable aux rayonnements ionisants. Il a été démontré que certains patients qui sont soumis à des irradiations thérapeutiques montrent une réponse à l’irradiation plus forte qu’attendu au niveau des tissus sains, aussi bien en termes d’effets précoces que tardifs. Les complications inhérentes aux surdosages au niveau des organes à risque justifient une évaluation des risques liés aux radiothérapies, mais aussi une prise en compte de la radiosensibilité individuelle du patient et de son statut génétique. Le problème de radiosensibilité individuelle est plus d’actualité que jamais face à l’apparition d’une diversification des types de faisceaux et notamment l’apparition des faisceaux de particules lourdes (hadronthérapie par ions légers tels les ions carbone) dont les indications relèvent précisément des situations de radiorésistance aux photons. C’est dans ce cadre que le programme de recherche expérimentale ROSIRIS (RadiobiOlogie des Systèmes Intégrés pour l’optimisation des traitements utilisant des rayonnements ionisants et évaluation du RISque associé) a été initié par l’IRSN et l’INSERM. Un des objectifs général de ce projet est le développement de la modélisation biophysique des événements précoces induits par les rayonnements ionisants, notamment la modélisation des événements stochastiques primaires. L’enjeu principal est de proposer une nouvelle définition de la dose d’irradiation qui rende mieux compte de l’hétérogénéité des événements physiques qui surviennent quelques 10-6s après l’irradiation à l’échelle du noyau cellulaire et/ou de la cellule afin de mieux prédire les effets biochimiques et biologiques correspondants. Il s’agit également de corréler les observables caractérisant les événements biologiques précoces aux événements physiques. L’originalité de l’approche réside dans l’utilisation des techniques les plus récentes d’identification des cassures double-brin de l’ADN. Les actions à mener sont de..

La méthode choisie pour l’étude des cassures doubles brins est l’observation des foci H2AX en microscopie par immunofluorescence. L’immunofluorescence avec des anticorps spécifiques contre les formes phosphorylées de l’histone H2AX (  -H2AX) permet en effet de mettre en évidence les al.) ont montré que la décondensation de la chromatine, notamment due à des cassures simple-brin de l’ADN (SSB) pouvait disperser le signal lumineux du focus initial et aboutir à la formation quasi-homogène de foci de plus petite taille. De plus, en plus du dénombrement automatique des foci et de leur taille, des tests peuvent être effectués, à dose macroscopique égale, avec des agents chimiques condenseurs/ou décondenseurs de l’ADN comme le DMSO, le butyrate de sodium ou certains agents intercalants. Enfin, des données préliminaires obtenues avec des irradiations cellulaires par des neutrons indiquent que le nombre, l’intensité lumineuse, la taille et la dispersion des foci varient drastiquement avec l’énergie incidente des neutrons Des techniques d’analyse d’image permettent de quantifier le nombre, la taille et l’intensité de chaque foci. Il est alors possible de corréler ces trois premières observables (nombre, taille et intensité des foci) aux événements physiques produits dans des conditions d’irradiation variées, à partir d’un grand nombre d’images pour chaque configuration différente d’irradiation. Une telle acquisition de données est aujourd’hui rendue possible par l’automatisation de la collecte des images microscopiques sur des plateformes automatisées. L’analyse de la répartition spatiale des foci et des alignements possibles des événements biologiques dans le noyau cellulaire irradié est plus complexe et nécessite un développement méthodologique plus important. A partir des données topologiques des dépôts d’énergie primaires obtenues par simulation, il est possible d’agréger (clusterisation ou voxelisation) ces dépôts afin de pouvoir les corréler aux dommages de l’ADN matérialisés par les foci  H2AX.