ANALYSE PHYLOGENETIQUE DES SOUCHES EPIDEMIQUES DE Vibrio nigripulchritudo (

ANALYSE PHYLOGENETIQUE DES SOUCHES EPIDEMIQUES DE Vibrio nigripulchritudo 

Cycle biologique 

La plupart des crevettes pénéides a un cycle alternant une phase marine et une phase estuarienne. Les différents stades du cycle biologique des crevettes pénéides sont schématisés sur la figure 9. Le cycle de vie des crevettes pénéides commence par la ponte des femelles au large (à plus de 20 mètres de profondeur). La femelle nage doucement tout en libérant ses œufs. Elle ouvre et ferme ses trois paires de pléiopodes pour propager les œufs de l’orifice génital dans la mer. Les femelles gravides de Penaeus monodon produisent 500 000 à 750 000 œufs. De ces œufs éclosent des larves planctoniques au stade « Nauplius » après 12 à 15 heures suite à la ponte (Fig. 9). Elles sont caractérisées par la présence de trois paires d’appendices constitués des antennules, des antennes et des mandibules et d’un œil unique médian, l’œil nauplien. Ces larves Nauplius utilisent leur réserve vitelline et croissent jusqu’au stade Zoé en passant par plusieurs mues successives en 36 heures. (Annexe II). Les larves au stade Zoé sont capables de s’alimenter et passent par trois stades successifs : Protozoé, Zoé 1 et Zoé 2 (Annexe III). Après ces trois mues successives, les larves croissent en Mysis. A ce stade, la larve possède déjà la morphologie des adultes mis à part que ses pattes thoraciques sont démesurées, dépourvues de pinces et servant à la nage, son appendice caudal et son rostre sont développés. Ce stade dure trois à quatre jours et la larve mysis croit en post-larve après trois mues successives (Annexe IV). Les post-larves pénètrent ensuite dans les estuaires ou se rapprochent de la côte et y croissent en juvéniles (Annexe IV), postjuvéniles et subadultes (les organes sexuels externes sont entièrement formés). Les subadultes continuent leur migration au large et deviennent des adultes. La première ponte a lieu à dix mois d’âge après le retour en mer, suivie de 2 à 3 autres pontes consécutives au cours d’une saison. Les adultes demeurent en mer jusqu’à 3 ou 4 ans d’âge après quoi ils meurent de prédation ou de maladie. Les apports d’eau douce, la précipitation, le balancement des marées, les forêts de palétuviers (mangroves) au niveau des estuaires et la température de l’eau, jouent des rôles importants sur la survie et la croissance des crevettes. En effet, les mangroves apportent beaucoup de matières organiques par la dégradation des feuilles et des troncs et constituent des zones nourricières pour les crevettes juvéniles côtières. En ce qui concerne le balancement des marées, il est faible à l’est et au sud de Madagascar ; par contre, le marnage est relativement important sur la côte ouest mais diminue toutefois du nord au sud. Ce qui explique en partie la distribution ou répartition des ressources crevettières malgaches. Par ailleurs, la température et la salinité des eaux influencent aussi directement la croissance des crevettes. Par exemple, selon Toussaint et al., (1994), P. monodon grossit deux fois plus vite à 28°C qu’à 24°C. Pour la concentration en sel, le point iso-osmotique des crevettes se situe autour de 20‰. 

Répartition géographique

 Les principales espèces de crevettes pénéides malgaches se localisent surtout au niveau de la côte Ouest de la grande île. Quelques sites de fréquentation des crevettes existent également à l’Est de Madagascar dans la baie d’Antongil et le long de la côte rectiligne. Par contre, elles sont rares ou inexistantes au grand Sud (Cavérivière et Rafalimanana, 2008). Les  crevettes pénéides vivent généralement en faible profondeur (Wabete, 2005) sur des fonds vaseux à sablo-vaseux, souvent turbides. Ces types de fond marin se rencontrent en majorité sur la côte ouest de Madagascar. Penaeus monodon se localise principalement sur les côtes nord-ouest et ouest du cap Saint Sébastien à l’estuaire de Mangoky. La répartition bathymétrique optimale observée à Madagascar varie de 3 à 10 mètres (Crosnier, 1964). La répartition géographique mondiale est sur la côte est de l’Afrique, Inde, Australie, Philippines, Japon (Crosnier, 1964) et généralement dans les pays tropicaux. 

Statut IUCN P. monodon est dans le catalogue du vivant mais elle ne figure pas dans la liste rouge des espèces menacées de l’IUCN (version, 2012.2). 

Vibrio nigripulchritudo 

Systématique

 Le genre Vibrio fait partie de la famille des Vibrionaceae décrite par Véron en 1965. V. nigripulchritudo a été décrit pour la première fois par Baumann et al., (1971) à partir d’échantillons d’eau océanique effectués au large des îles Hawaï. Quatorze souches ont été analysées et ont été assignées du nom de Beneckea nigrapulchrituda. Ce n’est que vers 1980 que Baumann et al., ont apporté des modifications en attribuant le nom de Vibrio nigripulchritudo à l’espèce. V. nigripulchritudo se situe dans la classification donnée ci-après : Domaine : Bacteria Phylum : Proteobacteria Classe : Gammaproteobacteria Ordre : Vibrionales Famille : Vibrionaceae Genre : Vibrio Espèce : Vibrio nigripulchritudo (Baumann et al.,1980)

Description culturale et biochimique

Les Vibrios sont des bacilles à Gram négatif (cf. II.2.3.2), de formes fréquemment incurvées, d’un diamètre compris entre 0,5 et 0,8 µm et d’une longueur comprise entre 1,4 et 13 2,6 µm (Fig. 10). Ils présentent habituellement une mobilité polaire due à un seul flagelle comme chez Pseudomonas bacterium (Fig. 11). Ils peuvent utiliser le métabolisme respiratoire ou fermentatif et leur croissance requiert la présence d’ions sodium (Lambert, 1998). Ces bactéries sont anaérobies facultatives.Du point de vue génétique, les vibrios possèdent deux chromosomes circulaires : le chromosome I, grand, bien conservé et qui porte la plupart des gènes essentiels pour la croissance, la viabilité et la virulence et le chromosome II, plus petit et contient plus de gènes relatifs à la régulation transcriptionnelle et au transport de substrat (Travers, 2008). En plus de ces deux chromosomes, les vibrions peuvent contenir un ou plusieurs plasmides (Fig. 12). Ce sont de petits ADN circulaires double brin se trouvant dans certaines bactéries en dehors du 14 chromosome (Etienne, 1993) et se répliquent de façon autonome grâce à des enzymes présentes dans la bactérie. Les plasmides n’ont pas de relation directe avec les chromosomes bactériens mais ils peuvent être transférés d’une bactérie à une autre (transduction, transformation ou sexduction bactérienne) et peuvent être incorporé au chromosome bactérien. Chez Vibrio nigripulchritudo, deux plasmides de 247,2 kb noté pA1066 (Le Roux et al., 2011) et 11,2 kb noté pSFn1 ou pB1067 (Reynaud et al., 2008), associés à la virulence des souches hautement pathogènes, a été mis en évidence en Nouvelle Calédonie. Une étude comparative d’un isolat HP (SFn1) et d’un isolat NP (SFn118) calédoniens a permis d’identifier 13 fragments spécifiques des souches HP (Reynaud et al., 2008). Un fragment d’ADN de ces souches HP présente plus de 90% de similitude au niveau de la séquence nucléotidique avec une séquence, dénommée Z2Z3 chez le plasmide de V. shilonii, un vibrion associé au blanchissement des coraux (Kushmaro et al., 2001). Cette similitude de séquence entre deux espèces différentes suggère la possibilité d’un transfert inter-espèce des facteurs de virulence via ces plasmides.

Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS ET ACRONYMES
GLOSSAIRE
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
LISTE DES ANNEXES
INTRODUCTION
I. MILIEU ET SITE D’ETUDE
I.1. Localisation des zones de collectes
I.2. Description du site aquaculture
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. Matériels biologiques
II.1.1. Crevettes hôtes : Penaeus monodon, Metapenaeus monoceros, Marsupenaeus
japonicus
II.1.1.1. Identification des espèces
II.1.1.1.1. Systématique
II.1.1.1.2. Caractéristiques des crevettes PENAEIDAE (Perèz-Farfante, 1998)
II.1.1.1.3. Clé de détermination (Crosnier, 1964)
II.1.1.1.4. Description morphologique .
II.1.1.2. Biologie et écologie
II.1.1.3. Répartition géographique
II.1.1.4. Statut IUCN
II.1.2. Vibrio nigripulchritudo
II.1.2.1. Systématique
II.1.2.2. Description culturale et biochimique
II.1.2.3. Caractères génétiques
II.1.2.4. Etiologie
II.1.2.5. Statut IUCN
II.2. Méthodologies
II.2.1. Collecte des échantillons de crevettes .
II.2.2. Sélection des souches d’études
II.2.3. Mise en culture et isolation bactérienne
II.2.4. Identification de l’espèce bactérienne .
II.2.4.1. Identification morphologique
II.2.4.2. Identification physiologique et biochimique : coloration gram, test de
l’oxydase, identification API 20E
II.2.4.3 . Identification biomoléculaire
II.2.4.3.1. Extraction d’ADN bactérien
II.2.4.3.2. Amplification par PCR
II.2.4.3.3. Identification de l’espèce V. nigripulchritudo par PCR
II.2.4.3.4. Révélation sur gel d’agarose
II.2.5. Utilisation de la technique PCR pour l’analyse MLST
II.2.5.1. PCR des six gène
II.2.5.2. Purification et séquençage d’ADN
II.2.5.3. Nettoyage et alignement des séquences nucléotidiques
II.2.5.4. Construction des arbres phylogénétiques
II.2.6. Utilisation de la technique PCR pour la détection des marqueurs moléculaires de virulence
III. RESULTATS ET INTERPRETATIONS
III.1. Identification de l’espèce bactérienne
III.1.1. Identification morphologique .
III.1.2. Identification physiologique et biochimique: coloration gram, test de l’oxydase,identification API 20E
III.1.3. Identification biomoléculaire
III.1.3.1. Résultats de l’extraction d’ADN bactérien
III.1.3.2. Résultats de l’amplification par PCR et visualisation sur gel d’agarose
III.2. Utilisation de la technique PCR pour l’analyse MLST
III.2.1. PCR des six gènes et visualisation sur gel d’agarose
III.2.2. Résultats de séquençage d’ADN
III.2.2.1. Vérification de séquence sur Chromas
III.2.2.2. Résultats de séquençage des isolats malgaches de V. nigripulchritudo
III.2.3. Nettoyage et alignement des séquences nucléotidiques
III.2.4. Analyse de relation phylogénétique
III.2.4.1. Arbre phylogénétique des isolats malgaches
III.2.4.2. Arbre phylogénétique des isolats malgaches et calédoniens
III.3. Détection des marqueurs moléculaires de virulence
IV. DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
WEBOGRAPHIE
ANNEXES

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