MATERIELS ET METHODES

Matériels utilisés

Matériel végétal

L’espèce choisie est le haricot (Phaseolus vulgaris) principalement pour son cycle de 90 jours adapté au délai imparti pour l’expérimentation. La variété utilisée est la « Vangamena » (FOFIFA CAL 98), une variété naine originaire de Tanzanie appartenant à la classe des haricots « red mottled », obtenue auprès du Département de Recherche Agronomique (DRA, FOFIFA). Ce sont des semences certifiées et signalées par les producteurs comme étant les plus saines en culture avec peu de perte (rendement pouvant dépasser les 1 500kg/ha) (Annexe V).

Produits utilisés

Des pilules contraceptives de la marque « Pilplan ® » (Laboratoire BAYER PHARMA AG, Allemagne) achetées en pharmacie ont été utilisées pour préparer la solution d’arrosage. Chaque comprimé contient un œstrogène synthétique: l’éthinylestradiol (0,03mg) et une progestérone: le levonorgestrel (0,15mg). C’est une pilule minidosée, c’est-à-dire que la quantité d’éthinylestradiol est inférieure à 40µg (Annexe I). Des résidus de graines de soja appelés aussi « Okara » ont été aussi utilisés. Leur obtention consiste à tremper les graines de soja dans l’eau durant une nuit, puis égoutter et faire bouillir pendant 15mn. Ensuite, les graines ont été broyées puis filtrées à l’aide d’une petite passoire au maillage très fin pour obtenir le lait. Les résidus de graines de soja ont été ainsi récupérés.

Méthodes

Mise en culture, traitements aux œstroprogestatifs et aux résidus de graines de soja

Les graines de haricot ont été mises à germer dans des bouteilles d’eau en polyéthylène translucide de 1,5l (Ø = 8cm ; H = 22cm), récupérées et nettoyées. Le tiers de la partie supérieure de la bouteille a été enlevé. La base a été ensuite percée de trous pour faciliter le drainage de l’excès d’eau. Le substrat est composé d’un mélange équivalent de compost, de terre rouge et de sable (1 :1 :1) préalablement séché. Chaque pot a été rempli de substrat jusqu’à environ 5cm de la limite supérieure, soit 1kg de substrat. Une seule graine a été semée dans chaque pot à 2cm de profondeur.
La première expérimentation consiste à tester l’effet d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la croissance et le développement de la plante. Les comprimés de « Pilplan ® » ont été dissous dans de l’eau de robinet pour atteindre une concentration finale de 8µg.l -1 . Le choix de cette concentration a été basé selon une étude portant sur la présence des hormones sexuelles dans différentes espèces de plantes (Kopcewicz, 1971a). Chaque individu a été arrosé avec 160ml de cette solution, deux fois par semaine. Les traitements suivants ont été appliqués :
– Traitement (OP): Arrosage avec la solution d’œstroprogestatifs.
– Témoin (TEM) : Uniquement un arrosage avec de l’eau de robinet.
La seconde expérimentation consiste à amender le substrat par des résidus d’extraction de lait de soja sous forme de « mulching » à différents stades de développement de la plante. La quantité de résidus de soja utilisée est de 2 cuillerées à soupe soit 100g par pot de culture. Les traitements suivants ont été appliqués :
– Traitement 1 (SG): Apport de résidus de graines de soja avant la germination.
– Traitement 2 (SV): Apport de résidus de graines de soja en début du stade végétatif, c’est-à-dire après l’apparition des deux premières feuilles au niveau de l’épicotyle.
– Traitement 3 (SF): Apport de résidus de graines de soja en début de floraison, c’est-à dire dès l’apparition du premier bouton floral.
– Témoin (TEM): Uniquement un arrosage avec de l’eau de robinet.

Expérience sous serre

Les cultures ont été réalisées sous confinement dans une serre pour permettre une récolte précoce mais aussi pour assurer une croissance homogène des individus et éviter les agressions externes (gel, parasites, …). Une serre en bois de (6×3×1,75m) a été construite et recouverte d’une toile en polyéthylène translucide soutenue par des lattes entrelacées. Deux ouvertures ont été aménagées pour permettre une meilleure circulation d’air dans la serre et abaisser la température intérieure. Les expériences ont été réalisées de juin à septembre 2015 et la température dans la serre variait de 40±1,2°C pendant le jour et de 7±0,5°C pendant la nuit. Les deux expérimentations ont été conduites simultanément dans la même serre et partagent le même lot d’individus témoins. Chaque traitement (OP, SG, SV, SF, TEM)comprend un lot de 30 individus répartis aléatoirement dans la serre soit un total de 150 individus.

Suivi des paramètres de croissance et de développement

Le suivi a été effectué deux fois par semaine de juillet à septembre. Plusieurs paramètres de croissance ont été évalués comme le taux de germination, la longueur et le poids des racines, le nombre et la dimension des nodules, la hauteur de la plante, la couleur des feuilles, le nombre de fleurs, le nombre de gousses, le nombre de graines (Annexe VI). La couleur des feuilles a été mesurée à l’aide d’une Plaquette Couleur Foliaire (Annexe IV).

Analyse de la faune du sol

Il s’agit d’analyser la faune présente dans le sol (Annexe III) au bout de trois mois de culture. La technique inventée par Antonio Berlese en 1905, permet d’extraire la faune de petite taille notamment des microarthropodes et des insectes présentes dans un échantillon de sol ou de litière (http 3). Une adaptation de la technique originale consiste à utiliser une bouteille vide en polyéthylène découpée en deux, le col a été inversé et inséré dans l’autre moitié comme un entonnoir. Une grille a été déposée sur la partie supérieure de cet entonnoir pour servir de tamis et retenir les sédiments mais laissant traverser les insectes et les arthropodes. Pour accélérer la récupération de ces derniers, une lampe a été suspendue au-dessus du montage pour chauffer l’échantillon de sol et faire fuir les insectes vers le col de l’entonnoir avant detomber dans le récipient contenant de l’alcool à 70°. Les résidus de graines de soja et la partie superficielle du sol (environ 140g, prélevée sur 5cm de profondeur) ont été traités séparément. Dix pots de culture sur 30 ont été analysés pour chaque traitement soit un total de 50 pots.

Analyses statistiques

Les données représentent les mesures effectuées sur 30 individus sauf dans les cas où les traitements ont causé une mortalité importante.
Afin d’analyser les effets de chaque facteur, une analyse de variance a été effectuée suivi d’un test de comparaison de moyenne de Fisher déterminant la plus petite différence significative (LSD: Least Significant Difference). Toutes les données expérimentales ont été traitées avec XLSTAT 2014. Toutes les analyses ont été effectuées avec un risque α égal à 0,05.
L’analyse « t-test » (http 4) a été effectuée afin de comparer les proportions dans deux échantillons différents.

RESULTATS

Le développement et la croissance des plants de Phaseolus vulgaris ont été suivis durant trois mois d’expérimentation sous serre. Les plants ont été soumis à deux différents traitements : (i) une exposition chronique aux œstroprogestatifs grâce à un arrosage régulier avec une solution de 8µg.l -1 d’un mélange d’éthinylestradiol et du levonorgestrel et (ii) un amendement du substrat par des résidus de graines de soja à différents stades de développement de la plante.
I Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la germination La germination des graines s’est déroulée entre le 2 ème et le 9 ème jour de culture. L’application de résidus de graines de soja avant la germination inhibe fortement (p<0,0001) celle-ci. En effet, cela a entrainé une diminution du taux de germination jusqu’à 36% (Figure 1A). Par contre, l’imbibition des graines par la solution d’œstroprogestatifs n’a aucun effet sur lepourcentage de germination (Figure 1B).

Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la croissance et le développement de la racine

Longueur des racines

L’amendement du substrat par des résidus de graines de soja stimule fortement l’élongation racinaire lorsque appliqué aux stades germinatif (p<0,0001) et végétatif (p=0,005). L’accroissement de la longueur de la racine est à plus de 8cm par rapport aux individus témoins (TEM=13,1cm). Toutefois, une application tardive de résidus de graines de soja, c’est-à-dire avant la floraison, n’a aucune influence sur la longueur des racines (p=0,09) (Figure 2A).
L’exposition chronique de la plante aux œstroprogestatifs stimule également l’élongation racinaire (p< 0,0001) avec une longueur moyenne de 23,85cm (Figure 2B).

Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la formation et la taille des nodules racinaires

L’application de résidus de graines de soja au niveau du substrat n’a manifestement aucun effet sur le nombre et la taille des nodules racinaires formés (Figure 4A). Suivant l’exposition chronique aux œstroprogestatifs, le nombre de nodules a augmenté de 100% avec une moyenne de 35 nodules par pied par rapport aux individus témoins (TEM=17 nodules), alors que leur dimension n’a pas varié de façon significative (Figure 4B).

Couleur des feuilles

Sous l’influence d’un amendement de résidus de graines de soja, les feuilles acquièrent une coloration verte plus foncée. Cette coloration plus intense des feuilles des individus traités aux stades précoces (germination et croissance végétative) est perçue dès la deuxième semaine et persiste jusqu’à la huitième semaine de culture. L’application tardive des résidus de graines de soja avant la floraison n’a qu’une faible influence positive sur la coloration verte des feuilles (Figure 6A). Par contre, les feuilles des individus traités aux œstroprogestatifs ont une coloration verte plus claire ( 3) par rapport aux témoins (Figure 6B).

Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la production de fleurs, de gousses et la production de graines

Production de fleurs

L’apport de résidus de graines de soja en début du stade végétatif accélère la formation de fleurs avec un pic de production de fleurs (3 fleurs) qui survient durant la huitième semaine, c’est-à-dire une semaine avant les individus témoins et les autres traitements SG et SF (Figure 7A). De plus, le traitement avec les résidus de graines de soja a entraîné un raccourcissement de la période de floraison de deux semaines. En effet, la production de fleurs est étalée jusqu’en 12 ème semaine pour les individus témoins alors qu’elle se termine dès la 10 ème semaine pour les individus traités. Cette réduction de la période de floraison a été observée également au niveau des plantes exposées aux œstroprogestatifs (Figure 7B).

Formation de gousses

L’apport de résidus de graines de soja aux stades végétatif et floraison montre un effet positif sur la production totale de gousses. En comparant ces deux traitements, les individus traités au stade végétatif ont formé beaucoup plus de gousses par rapport aux individus traités en début de floraison (p= 0,0448). Cependant, environ ¾ des gousses produites par la plante tombent avant leur maturité. De ce fait, seuls les individus traités au stade végétatif présentent un nombre de gousses significativement plus élevés (p=0,0016) soit en moyenne 2 gousses par plant par rapport au témoin (TEM=1gousse) (Figure 9A).
La diminution du nombre de gousses à la récolte est aussi observée après exposition aux œstroprogestatifs. Cependant, ce traitement n’a aucune influence sur la totalité de gousses produites (Figure 9B).

Nombre de graines

L’application de résidus de graines de soja aux stades végétatif et floraison a fortement stimulé la production de graines. Visiblement, la productivité augmente suivant le stade d’application du traitement. Ainsi, les individus qui ont reçu tardivement leur traitement (avant la floraison) sont les plus productifs (p= 0,0003) avec en moyenne 6 graines par plant ce qui présentent une augmentation de plus de 100% du nombre de graines par rapport aux individus témoins (TEM=3graines) (Figure 10A).
L’exposition aux œstroprogestatifs n’affecte pas le nombre de graines des plants de haricots traités (Figure 10B).

Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la faune du sol

L’analyse du substrat de culture a montré que les collemboles et les acariens sont les plus abondants parmi les faunes au niveau de la partie supérieure (sol de surface). Toutefois, pour les traitements avec des résidus de graines de soja, les acariens représentent la majorité des individus recensés dans le sol. Au niveau du traitement SV, un cas exceptionnel est remarqué, les collemboles sont les plus abondants (30 collemboles) (Figure 11A). L’analyse des « mulchs » récupérés au niveau de chaque traitement montre une prépondérance des acariens par rapport aux collemboles (Figure12).
L’exposition aux œstroprogestatifs n’a manifestement aucun effet sur l’abondance de collemboles ou d’acariens dans le sol (Figure 11B).

DISCUSSIONS

Effets inhibiteurs des résidus de graines de soja sur la germination des graines de Phaseolus vulgaris

Un très faible taux de germination a été observé sur les individus traités aux résidus de graines de soja avant la germination. D’un côté, les conditions nécessaires à la germination ont été perturbées car malgré l’effet « mulch », qui préserve l’humidité du sol, il peut y avoir une accumulation trop importante de celle-ci (http 5). Un sol trop humide conduirait à l’asphyxiede la graine, et par conséquent une perte de son pouvoir germinatif. D’un autre côté, la graine de soja est riche en composés phénoliques comme les isoflavones (annexe II). Ces composés, lorsque mis en contact avec le tégument de la graine en germination ont la capacité de piéger l’oxygène et entrainent son asphyxie (http 6). Ces composés sont aussi impliqués dans les phénomènes d’allélopathie en contrôlant la germination d’autres espèces concurrentes. Les travaux de Macias et al. (1999) sur la germination de l’ail confirme le potentiel allélopathique des isoflavones. De plus, il a été rapporté chez le cotonnier que le pouvoir germinatif des graines dépend de l’élimination au préalable des composés phénoliques contenus dans leur tégument (Brzozowska et Hanower, 1976). Par ailleurs, quand le « mulch » a subi une déshydratation il devient très compact et constitue une barrière à l’émergence de l’épicotyle. Ce qui pourrait expliquer l’incapacité de la majorité des graines à germer entraînant par la suite leur pourrissement. Celles qui, malgré cela, sont parvenues à émerger ont subi des blessures au niveau de l’apex tandis que d’autres ont rapidement germé évitant par conséquent cet obstacle. En effet, le soja contient des lécithines qui, par leur effet émulsifiant, donnent au « mulch » une structure collante et pâteuse (Aboiron et al., 2004) qui devient très compacte en se déshydratant. Une autre explication à la forte mortalité des graines en présence de « mulch » de soja est
l’odeur de pourriture dégagée par ce dernier qui est susceptible d’attirer des ravageurs comme les mouches des semis Delia platura. Les larves de ces mouches rongent les cotylédons annihilant la capacité des plantules à se développer (Schiffers et Labuschagne, 2011).

Effets stimulateurs des résidus de graines de soja sur la croissance de Phaseolus vulgaris

Un des éléments importants pour l’élongation racinaire est le phosphore dont le besoin chez le haricot est estimé entre 40 à 60kg/hectare (Hallouin et al., 2012). Pour les individus traités aux résidus de graines de soja aux stades semis et végétatif, une élongation significative de la racine a été observée. Or les résidus de graines de soja ne renferment qu’une faible quantité de phosphore (0,06g de phosphore/100g de résidus) (http 7). Il est alors peu probable que l’effet positif sur la croissance racinaire ait été consécutif à un apport de phosphore via l’addition de résidus de graines de soja. Par contre, les isoflavones pourraient influencer la croissance et le développement des plantes en interagissant d’une manière complexe avec diverses hormones de croissance (Yezza et Bouchama, 2014). Des études ont mis en évidence l’action inhibitrice ou stimulatrice des polyphénols sur les auxines (AIA: Acide ß – Indole Acétique) et les enzymes responsables de leur destruction catabolique, en particulier l’AIA-oxydase (Brzozowska et Hanower, 1976 ; Macheix et al., 2005). En effet, l’action des composés phénoliques, consiste à inhiber l’AIA-oxydase empêchant la dégradation rapide de l’AIA favorisant ainsi la formation des racines. De même, au niveau des tiges, l’accumulation d’auxine aurait favorisé leur élongation (Brzozowska et Hanower, 1976).
Les résidus de graines de soja renferment une quantité importante de protéines et d’acides aminés (Sojaxa, 2012) qui en se dégradant libèrent de l’azote ammoniacal NH4 + (http 8), la forme d’azote assimilable pour la plante. Cet apport d’azote supplémentaire par l’ajout de résidus de graines de soja aurait stimulé la croissance des plantes traitées. En effet, la couleur des feuilles du lot traité avec les résidus de graines de soja est d’un vert plus intense par rapport au lot témoin. L’intensité de la couleur des feuilles est directement liée à la teneur en chlorophylles et à la teneur en azote foliaire (Chaudhary et al., 2003). Un des éléments principaux entrant dans la composition des chlorophylles est l’azote (Deroche, 1983).
Dans le cas du haricot, les besoins en azote étant estimés entre 50 et 60kg/ha et un apport aux différents stades de développement est nécessaire pour obtenir un bon rendement (Hallouin et al., 2012). Cependant, l’application de résidus de graines de soja en début de floraison a entraîné un dessèchement progressif des organes en commençant par les feuilles suivie de la plante entière. Cette perturbation peut être due à une concentration trop élevée d’azote apportée par le soja en favorisant des maladies comme la rouille (Hallouin et al., 2012). Dans une étude sur la culture de haricot (Schiffers et al., 2011), l’apport en azote est nécessaire avant ou en même temps que le semis, en début de végétation (absence de nodosités fixatrices) et en début de floraison, mais un apport tardif allonge le cycle, diminue le rendement et donne des conditions favorables au développement de la rouille.

Effets des résidus de graines de soja sur la floraison et fructification

En début de floraison, un apport en azote est nécessaire chez le haricot pour une bonne formation des gousses et des graines (Hallouin et al., 2012). Si les résidus de graines de soja apportent une grande quantité d’azote, ceci retarderait la mise à fleur de la plante alors qu’une carence en azote favoriserait la floraison précoce (William, 2003; http 9). Or, il a été rapporté que certaines phytoestrogènes appartenant au groupe des isoflavonoïdes stimulent la floraison (Macheix et al., 2005 ). Ainsi, grâce aux isoflavones de soja, l’initiation florale pourrait avoir été favorisée et le nombre de fleurs augmenté.
Le nombre total de fleurs formées au cours de la vie de la plante ne correspond pas au nombre total de gousses obtenues. Cela suggère qu’un certain nombre de fleurs aient avorté entraînant un nombre de gousses plus faible à la récolte. D’après les études de Tremblay et Michaud (1960), une chaleur nocturne excessive au stade de floraison faisait avorter un grand nombre
de fleurs. Or les variations de la température nocturne au cours de l’expérience n’ont pas dépassé les 10°C. Toutefois, dans la culture du haricot, les fortes chaleurs (35°C) peuvent perturber la fécondation, la formation et le développement des gousses (Hallouin et al., 2012).
En effet, les températures de la serre durant la journée ont atteint les 40°C, ce qui aurait doncentrainé la diminution du nombre de fleurs et par conséquent le nombre de gousses.

Effets des œstroprogestatifs sur la croissance

La solution d’œstroprogestatifs a été appliquée de manière chronique aux semis, par l’intermédiaire de l’eau d’arrosage, jusqu’à la récolte des gousses de Phaseolus vulgaris. Un nombre maximal de graines (97%) ont germé. Il a donc été conclu que la solution d’hormones contraceptives testée n’a aucun effet manifeste sur la germination du haricot. Ce résultat corrobore celui de Hewitt et al. (1979 a) qui a montré que les œstrogènes n’ont aucun effet sur la germination des graines de Phaseolus vulgaris. Des études ont affirmé que selon la concentration d’œstroprogestatifs appliquée aux plantes, les effets peuvent être bénéfiques ou au contraire néfastes pour leur croissance et leur développement (Janeczko et Skoczowski, 2005). Avec une concentration de 8µg.l -1 dans l’eau d’arrosage, aucun effet n’a été observé sur la croissance en hauteur.

Table des matières

REMERCIEMENTS 
TABLE DES MATIERES 
LISTE DES ABREVIATIONS 
LISTE DES FIGURES 
LISTE DES PHOTOS 
LISTE DES ANNEXES
GLOSSAIRE 
INTRODUCTION 
MATERIELS ET METHODES 
I Matériels utilisés
II Méthodes 
II.1 Mise en culture, traitements aux œstroprogestatifs et aux résidus de graines de soja
II.2 Expérience sous serr
II.3 Suivi des paramètres de croissance et de développement
II.4 Analyse de la faune du sol
II.5 Analyses statistiques
RESULTATS
I Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la germination
II Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la croissance et le développement de la racine
III Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la formation et la taille des nodules racinaires
IV Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux
œstroprogestatifs sur la croissance de la tige et l’évolution de la couleur des feuilles
V Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux œstroprogestatifs sur la production de fleurs, de gousses et la production de graines
VI Effets d’un apport de résidus de graines de soja ou d’une exposition chronique aux
œstroprogestatifs sur la faune du sol
DISCUSSIONS 
Effets inhibiteurs des résidus de graines de soja sur la germination des graines de Phaseolus vulgaris
Effets stimulateurs des résidus de graines de soja sur la croissance de Phaseolus vulgaris
Effets des résidus de graines de soja sur la floraison et fructification
Effets des œstroprogestatifs sur la croissance
Effets stimulateurs des œstroprogestatifs sur la partie racinaire
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
REFERENCES WEBOGRAPHIQUES 
ANNEXES 
Annexe I 
Annexe II 
Annexe III 
Annexe IV 
Annexe V 
Annexe VI 
ABSTRACT
RESUME