Collecte des larves et élevage des moustiques

Les larves et nymphes d’An. gambiae s.l. ont été prélevées, à l’aide de louches, au niveau de gîtes larvaires prospectés et géo-référencés. Des bacs en plastique ont été utilisés pour recueillir les larves récoltées, et des passoires à mailles adaptées pour les filtrer. Le tri des larves et nymphes ainsi que la purification des bacs (élimination des larves de Culicinae et potentiels prédateurs), a été effectué avec des pipettes. Transvasées dans de petits seaux (spécifiques de chaque gîte), les stades pré-imaginaux collectés ont été acheminés à un insectarium provisoirement aménagé dans les locaux du laboratoire d’entomologie médicale de l’IRD où ils ont été élevés jusqu’à émergence.

Répartition des larves et alimentation

Durant toute la durée de l’élevage, un lot de bacs plastiques (33 x 22,5) et de pipettes a été affecté à chaque gîte larvaire. A l’insectarium un effectif de 600 à 1200 larves de même stade a été maintenu dans chaque bac (rempli à moitié par l’eau du gîte) (Boudin et al., 1989). Les larves étaient nourries avec un aliment à base de farine pour alevins, commercialisé sous lenom de Tetra Min Baby ®. Cette formule en poudre, riche en protéines et en levures naturelles, constitue une nourriture complète pour alevins de poissons tropicaux de moins d’un centimètre et convient parfaitement à une croissance larvaire optimale. La quantité de poudre à verser dans un plateau est corrélée au stade larvaire. Les larves de stade I ont ainsi reçu une quantité médiocre de farine, alors que 300 et 450 mg de poudre ont été versés dans les bacs contenant respectivement des larves de stades II et III (ou IV) (Boudin et al., 1989 ; Diop et al., 1998).

Recueil des nymphes

Les nymphes ont été quotidiennement triées à la pipette et déposées dans des cristallisoirs à moitié remplis d’eau, entre 8h et 10h (Diop et al., 1998). Les nymphes de chaque gîte ont été transférées dans une cage d’émergence cubique (de 17,5 cm d’arête) recouverte d’un tulle moustiquaire dont l’une des faces présentait une ouverture circulaire contiguë à un manchon permettant d’effectuer diverses manipulations. La date suivant immédiatement celle du recueil des nymphes a été marquée sur les cages comme date d’émergence, sachant que pour An. gambiae s.l., cette dernière a lieu 12 à 24 heures après le stade nymphal (Boudin et al., 1989). Les nymphes n’ayant pas émergé ont été récupérées et rajoutées à celles qui venaient d’être recueillies.Les adultes exigent une température de 25°C-28 °C et une humidité relative allant de 70% à 80 %. Les cages sont recouvertes de serpillières mouillées qui apportent ainsi l’humidité requise. Du coton imbibé d’un tampon sucré 10% déposé sur les cages permet aux moustiques de s’alimenter. Pour éviter toute fermentation, le coton est changé tous les 2 jours.

Ces bouteilles ont été au préalable soigneusement lavées au savon liquide et rincées à l’eau de robinet, puis à l’eau distillée. Après lavage, elles ont été séchées à l’étuve, à une température de 50°C-60 °C, pendant 30 à 60 minutes. Leurs capuchons (en plastique) ont été également lavés de la même manière, mais leur séchage dans l’étuve exigeait une température plus basse (45°C). La méthode de lavage utilisée est détaillée à l’annexe 3. II. 3. 3 Insecticides testés Des molécules appartenant aux quatre familles (Pyréthrinoïdes, Organochlorés, Organophosphorés et Carbamates) ont été utilisées. Ces produits nous ont été fournis par le Centers for Disease Control (CDC) qui, en même temps, a défini la dose et le temps diagnostiques pour chaque insecticide (annexe 1). Les insecticides étaient déjà formulés en solutions pures hyper concentrées (100X). Des dilutions ont été faites dans de l’acétone pure (> 99 %, Sigma Aldrich) pour obtenir la dose diagnostique de chaque insecticide. Par ailleurs, des solutions stocks (ou solutions mères) à la dose diagnostique de chaque molécule et dont 1ml est à utiliser pour l’imprégnation d’une bouteille ont été préparées. Les procédures de préparation des solutions d’insecticide sont disponibles sur le site du CDC (http://www.cdc.gov/malaria). Les quantités nécessaires d’insecticide (à leur dose diagnostique) à dissoudre dans différents volumes d’acétone pure sont rapportées en annexe 2.

Après imprégnation, les bouteilles ont été mises à sécher (disparition complète des traces de liquide) puis immédiatement utilisées ou conservés (avec leurs capuchons) dans un placard à l’abri de la lumière, pour les bio-essais ultérieurs (Figure 10). Le temps de conservation avant utilisation des bouteilles imprégnées peut varier de 12 heures à 5 jours de stockage. Ensuite, des échantillons de 80 à 125 moustiques répartis dans 5 aspirateurs, à raison de 20 à 25 moustiques/aspirateur, sont maintenus en observation pendant 3 à 5 minutes dans les tubes d’aspirateur. Enfin, ces échantillons de moustiques ont été délicatement introduits dans 5 bouteilles, 4 imprégnées et une témoin (Figure 11a) et exposés aux insecticides pendant 120 minutes. La mortalité a été immédiatement relevée. Par la suite, elle a été déterminée toutes les 15 minutes pendant la première heure d’exposition, c’est-à-dire, aux intervalles de temps 0 ; 15 ; 30 ; 45 ; 60 ; 75 ; 90 ; 105 ; 120 minutes.