CONTRIBUTION A LA DETERMINATION DE TRACES DE PESTICIDES AROMATIQUES DANS LES EAUX NATURELLES

Bases théoriques et analytiques de la fluorimétrie

La Fluorescence est un outil efficace d’analyse et d’investigation largement utilisée dans des domaines très variés [6]. Dans l’agroalimentaire elle est utilisée pour la détermination du degré de toxicité et d’altération des produits, la recherche de résidus de pesticides dans les fruits, les légumes, etc. Dans le domaine médical et pharmaceutique la fluorescence permet l’analyse des liquides physiologiques (sang, plasma, urines, larmes, etc.), l’étude de la structure et l’ultra structure cellulaire notamment le séquençage de l’ADN, la recherche des drogues (dopage), le contrôle de la qualité des produits pharmaceutiques. Dans le domaine spatial, elle est utilisée pour la recherche des résidus organiques dans des poussières d’origines extra-terrestres et dans la récupération des engins spatiaux. Dans la technologie, elle sert à la production des lasers. Cette technique analytique repose sur l’émission d’une radiation lumineuse à partir d’un analyte ou d’un dérivé fluorophore excité. Dans le cas où l’analyte n’émet pas, il est transformé en un dérivé fluorescent à l’aide d’un sensibilisateur approprié par une méthode de dérivatisation [2,6]. Les sensibilisateurs généralement employés sont l’OPA (l’orthophthalaldéhyde), la fluorescamine et le chlorure de dansyl

Bases théoriques

La spectroscopie de fluorescence

La fluorimétrie nécessite la maîtrise de l’instrumentation utilisée et de la spectroscopie d’absorption. Elle demande aussi la prise en compte de tous les effets affectant le signal de fluorescence 

Excitation et émission de fluorescence

Lors de l’émission de fluorescence comme dans l’absorption, la transition électronique se fait de façon verticale (principe de franck Condon) car la durée de la transition est très négligeable (1 fs) devant le temps que mettraient les noyaux relativement lourds pour se déplacer (1 A° en 100 fs) [6,7]. Etant donné que l’énergie émise est inférieure à l’énergie absorbée, le spectre de fluorescence est décalé vers le domaine des grandes longueurs d’ondes par rapport au spectre d’excitation (Fig.I.A.1). C’est le déplacement dit de Stokes.  Fig. I.A. 1. Spectres d’excitation (a) et d’émission (b) du mélange histaminefluorescamine en solution aqueuse. Pour un même solvant le pic d’émission ne change pas de position en faisant varier la longueur d’onde excitatrice. La variation de l’excitation se traduit simplement par une diminution de l’intensité Alphonse Mendy – DEA – Chimie Physique Appliquée à l’Energie Laboratoire de Photochimie et d’Analyse (LPA)- Dpt de Chimie – FST- UCAD 13 d’émission; ce qui permet de ne pas confondre le pic d’émission de fluorescence avec les pics de diffusion de Rayleigh et de Raman [8].  Diffusion Rayleigh L’intensité du pic dépend de la polarisabilité des molécules du solvant. Ces dernières réémettent dans toutes les directions une petite fraction de la lumière excitatrice pour des multiples entiers de la même longueur d’onde de la radiation excitatrice [9].  Diffusion Raman L’intensité du pic est 100 à 1000 fois plus faible que celui de Rayleigh et sa position se trouve du côté des grandes longueurs d’onde car correspond au transfert d’une petite partie de l’énergie excitatrice aux molécules du solvant sous forme d’énergie vibrationnelle. Ensuite, ces molécules réémettent des photons de moindre énergie. La plus grande particularité de ce pic est que pour un même solvant la différence d’énergie entre les photons absorbés et les photons réémis est une constante ; ce qui fait qu’en déplaçant la longueur d’onde d’excitation, le pic de Raman change de position [9,10].

Facteurs affectant le signal de fluorescence

La fluorescence (F) est un processus compétitif et son intensité dépend de l’importance relative des autres processus concurrents de désactivation de l’état excité décrits dans le diagramme de Jablonsky. Ainsi, la présence d’autres types de molécules favorise le transfert d’énergie (TE) au dépend de la fluorescence. Une élévation de température favorise les processus de désactivation non radiatifs: La relaxation vibrationnelle (RV) suivie d’une conversion interne (CI), la conversion intersystème (CIS), et les réactions Alphonse Mendy – DEA – Chimie Physique Appliquée à l’Energie Laboratoire de Photochimie et d’Analyse (LPA)- Dpt de Chimie – FST- UCAD 14 photochimiques (R) avec des molécules du milieu. La somme des rendements quantiques de tous ces processus doit être égale à l’unité, soit : ΦF + ΦCI + ΦCIS + ΦTE + ΦR = 1 [7]. Le solvant, le pH, la concentration et la structure de l’analyte ont aussi des effets non négligeables sur le signal de fluorescence. C’est ainsi que la planéité et la rigidité des molécules sont favorables à l’émission de fluorescence [10]. D’autre part les composés insaturés comportant un système conjugué d’électrons π délocalisés sont en général fluorescents, contrairement aux molécules saturées qui subissent une prédissociation dans l’UV lointain. Ainsi, le phénol est très fluorescent alors que le cyclohexanol ne l’est pas. Les groupements électrodonneurs (-OH, CH3O-, -NH2, etc.) tendent à exalter le signal de fluorescence tandis que les groupements électroattracteurs (-NO2, -CO2H, -X, etc.) provoquent une extinction plus ou moins importante du signal [10]. Par conséquent, avant toute étude analytique, la prise en compte de tous ces facteurs est nécessaire [6, 7,10].