Contrôle redox de l’activité de Yap1 par les peroxydes

L’activation de Yap1 peut aisément être mesurée par la quantification de l’expression de l’un de ses gènes cibles, la thiorédoxine 2 (TRX2) [121]. Après traitement des cellules au H2O2 (0,4 mM), l’expression de TRX2 augmente rapidement, atteint un maximum après 30 minutes d’exposition, puis redescend à son niveau de base après 60 minutes (Fig. 14A). Ce profil d’expression est caractéristique de la réponse génomique, observée pour les gènes cibles de Yap1 après induction H2O2 (doses moyennes et faibles) ([22]; Biteau et Toledano, données du laboratoire). L’activation de Yap1 peut également être suivie par l’observation de sa localisation sub-cellulaire [183] grâce à l’utilisation d’une fusion GFP-Yap1. En absence de stress, Yap1 est majoritairement cytoplasmique. L’exposition des cellules au H2O2 (0,3 mM) entraîne une accumulation nucléaire de Yap1 dès 12 minutes de traitement (Fig. 14B). Cette concentration de Yap1 dans le noyau est transitoire; Yap1 est présent de façon prépondérante dans le noyau pendant la première demi-heure de traitement, puis redevient progressivement cytoplasmique avec un retour à la situation basale après 1 heure.La partie C-terminale de Yap1, aussi appelée c-CRD pour « Cysteine Rich Domain » , contient le signal d’export nucléaire (NES) entouré de 3 residus cystéines, C598, C620 et C629 (Fig. 13). La mutagénèse simultanée de ces trois cystéines empêche l’accumulation nucléaire de la protéine après induction [186].

 Yap1 est oxydé in vivo en réponse au H2O2

Des cellules exprimant myc-Yap1 ont été exposées ou non pendant 2,5 min à 0,4 mM d’H2O2 (lignes 1 à 4) ou à 1 mM de t-butyl-hydroperoxyde (lignes 5 et 6), puis lysées en présence de TCA. Après resuspension du précipitat en présence d’iodoacétamide, les extraits protéiques ont été séparés sur gel dénaturant non réducteur et révélés au moyen de l’anticorps anti-myc 9E10. La seule différence existant entre les lignes 1 et 2, et 3 et 4 réside dans le fait que les précipitats après TCA des lignes 3 et 4 ont été préalablement traités avec 200 mM de DTT avant resuspension en présence d’un excès d’iodoacétamide (3,2 M). B. Cinétique d’oxydation de Yap1. Des cellules exprimant myc-Yap1 ont été exposées à 0,4 mM de H2O2 pendant les temps indiqués.

Les extraits ont été réalisés comme décrit en A (lignes 1 et 2), puis traités à la phosphatase alcaline et séparés sur gel dénaturant réducteur ou non réducteur. C. Détermination de la dose minimale de H2O2 nécessaire à l’oxydation de Yap1. Des cellules exprimant myc-Yap1 ont été exposées pendant 5 min au doses de H2O2L’absence de réactivité du mutant Yap1C598T,C620A,C629T et la présence de ces résidus cystéines au sein d’un domaine de régulation essentiel, nous ont conduit à rechercher l’existence d’une oxydation in vivo de Yap1 en réponse au H2O2. La nature labile des modifications redox ainsi que leur propension à survenir par simple exposition à l’air nous ont amenés à utiliser un protocole d’extraction des protéines adapté [152]. Les cellules sont lysées en absence d’agent réducteur et en présence d’acide trichloroacétique (TCA), qui permet en abaissant très fortement le pH de maintenir les cystéines dans leur état redox natif : les ponts disulfures déjà présents dans la cellule sont maintenus, alors que la protonation des thiols prévient l’oxydation non spécifique des cystéines libres. La re-solubilisation des protéines, par re- suspension du culot protéique à pH alcalin, est réalisée en présence d’un agent alkylant des thiols, l’iodoacétamide. Les cystéines libres, qui ont ainsi été bloquées, ne présentent plus de réactivité à l’oxydation lors des étapes ultérieures. Les protéines sont ensuite séparées sur un gel dénaturant en conditions non réductrices. Si l’oxydation d’une protéine s’est traduite in vivo, par la formation d’un pont disulfure intramoléculaire, le changement de conformation induit par la présence de cette modification covalente entraînera une altération de la migration électrophorétique de la protéine oxydée par rapport à la protéine réduite. Nous avons ainsi observé qu’après traitement des cellules au H2O2, une forme de Yap1 étiquetée avec 9 épitopes myc (myc-Yap1) adopte une migration électrophorétique plus rapide, visible uniquement en conditions non réductrices (Fig. 15A, lignes 1 et 2). L’ajout de DTT lors de l’électrophorèse abolit la différence de migration visible entre les échantillons non induit et induit au H2O2 (Fig. 15A, lignes 3 et 4), indiquant que le changement de migration observé enconditions non réduites est lié à une oxydation de Yap1 par le H2O2. L’exposition des cellules au t-butyl-hydroperoxyde (t-BOOH) reproduit également cette altération de migration (Fig. 15A, lignes 5 et 6). Cette oxydation de Yap1 intervient très rapidement (2,5 minutes après traitement au H2O2) (Fig. 15B), et reste maximale pendant 15 minutes. Puis, la réduction de Yap1 s’amorce dès 30 minutes d’exposition au H2O2 pour être totale après 60 minutes d’induction. L’oxydation de Yap1 est observée pour de faibles doses de H2O2 (100 mM) et est maximale dès traitement des cellules avec 200 mM de H2O2 (Fig. 15C).