Etude de l’activite analgesique de l’Extrait sKd88 chez les rats

PARTIE CHIMIQUE 1- EXTRACTION

Des feuilles de la plante SKD88 ont été récoltées au mois d’Août 2014. Les feuilles fraîches ont été séchées à l’ombre pendant deux semaines et broyées à l’aide d’un broyeur à marteau. Cinq cent grammes de la poudre obtenue ont été macérés à froid dans un mélange éthanoleau (60 :40) pendant trois jours. Le macérât a été filtré à l’aide d’un papier filtre et évaporé sous vide à l’aide d’un évaporateur rotatif (EVAPOTEC®) à la température de 80°C pour éliminer le solvant (figure 2). L’extrait sec obtenu a été pesé pour calculer le rendement de l’extraction. Broyage Macération avec un mélange éthanol-eau (60 : 40) Filtration Evaporation à sec avec un rotavapor sous vide à 80°C Figure 2. Schéma résumant la préparation de l’extrait SKD88.

CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE

Une série de tests a été menée pour identifier les grandes familles chimiques présentes dans l’extrait hydroalcoolique en utilisant des réactifs spécifiques. En présence de ces réactifs la famille correspondante réagit par l’apparition de précipités ou par un changement de coloration (FONG H.H.S. et coll., 1977). La proportion relative de chaque famille chimique a été exprimée en utilisant les signes suivants : – : Absence de la famille chimique recherchée. + : Présence à faible concentration. ++ : Présence à moyenne concentration. +++ : Présence à forte concentration. 6 Tableau I. Tests utilisés pour le criblage phytochimique (FONG H.H.S. et coll., 1977). FAMILLES CHIMIQUES TESTS REACTIFS OBSERVATIONS ALCALOÏDES DRAGENDORFF MAYER WAGNER Précipitations TANNINS Gélatine + NaCl Précipitation verte : Tanins Catéchiques gélatine+ FeCl3 Précipitation bleue : Tanins galliques POLYPHENOLS Gélatine 1% Précipitation STEROÏDES ET TRITERPENES LIEBERMAN BURCHARD Anhydride acétique + H2(SO4) -Coloration pourpre : Terpénoides -Coloration violet ou bleu : Stéroïdes BADGET KEDDE Acide picrique Coloration rouge : Stéroïdes lactoniques FLAVONOÏDES LEUCOANTHOCYANES WILLSTATER Ruban de Mg + HCl concentré Coloration rouge Flavones Coloration violacée : Flavanones, Flavanols Coloration rouge à pourpre : Flavonols BATH-SMITH HCl concentré Intensification de Couleur POLYSACCHARIDES + 3 V éthanol Trouble SUCRES REDUCTEURS Liqueur de Fehling Bain-marie : précipitation rouge brique COUMARINES NaOH 10% Fluorescence à l’UV SAPONINES MOUSSE HCl + agitation Persistance d’une mousse (3cm d’épaisseur) 30 min après agitation

TESTS PHARMACOLOGIQUES

Des tests in vivo chez les rats ont été réalisés pour étudier l’effet analgésique périphérique et/ou central de l’extrait SKD88. Le test utilisant un algésimètre pour évaluer son activité périphérique, et le « tail flick » (queue immergée dans l’eau chaude) pour son activité centrale. 

ANIMAUX D’EXPERIMENTATION

Les tests biologiques ont été effectués sur des rats de race WISTAR femelles adultes âgés de 8 à 10 semaines, élevés à l’animalerie du LPGPC. Ils ont été nourris avec de la provende LFL1420 à raison de 50 g/Kg une fois par jour, et ont eu de l’eau à volonté.

ETUDE DE L’ACTIVITE ANALGESIQUE

Deux tests ont été effectués pour étudier l’activité analgésique de l’extrait SKD88. Son activité analgésique périphérique a été étudiée sur son effet vis-à-vis de la douleur provoquée par l’injection d’adjuvant complet de Freund, tandis que son activité analgésique centrale a été étudiée sur son effet vis-à-vis de la douleur provoquée par une stimulation thermique. a- Etude de l’activité analgésique périphérique L’activité analgésique périphérique de l’extrait SKD88 a été étudiée par son effet vis-à-vis de la douleur induite par l’injection sous-cutanée d’adjuvant complet de Freund (ACF) dans le coussinet de la patte arrière du rat. L’injection de l’adjuvant complet de Freund dans le coussinet plantaire du rat provoque une inflammation qui se manifeste par une augmentation du volume de la patte de l’animal ainsi qu’une douleur persistante. Cette inflammation apparaît dans les deux heures qui suivent l’injection et persiste jusqu’à 1 à 2 semaines. La douleur qui en résulte peut être évaluée à l’aide d’un algésimètre en exerçant une pression comme stimulus nociceptif (REN K. et DUBNER R., 1999). 8 Un algésimètre muni d’une aiguille de 0,785 mm2 de surface a été utilisé au cours de ce test. La pression exercée sur la patte du rat a été calculée suivant la valeur de la masse indiquée par l’algésimètre selon les formules suivantes (LE PARC G. et BRIAND P., 2010): Où : Pα (Pa) = Pression appliquée Poids (N) = masse (kg) × pesanteur g (N/kg) Avec g= 9,81 N/Kg (pesanteur) Une semaine avant le test, la patte des rats a été présentée à l’algésimètre pour les habituer au test (GAINOK J. et coll., 2011) et la pression qui a provoqué la réaction de chaque animal a été enregistrée comme pression de base. Après 7 jours de conditionnement, 50 µl d’ACF ont été injectés dans le coussinet plantaire de la patte arrière droite des rats pour induire une inflammation (SUN S. et coll., 2012). Vingtquatre heures après l’injection de l’ACF, une pression croissante a été appliquée sur la patte enflammée du rat à l’aide d’un algésimètre, et l’intensité de la pression qui a provoqué la réaction de l’animal a été notée (WALKER K. et coll., 2000). Ensuite, les animaux ont été répartis en 3 lots: un lot témoin et 2 lots ont été traités avec l’extrait à différentes doses. Les animaux du lot témoin ont reçu de l’eau distillée et ceux des autres lots ont reçu l’extrait SDK88 à la dose de 400 mg/kg ou 800 mg/kg par voie orale dans un volume de 10 ml/kg (ADEYEMI O.O. et coll., 2004). Après 15, 45, 90, 120, 240 minutes et 24 heures de l’administration de l’extrait, une pression croissante a été appliquée sur la patte enflammée de chaque rat à l’aide de l’algésimètre. Le stimulus a été arrêté dès que l’animal a réagi à la pression. L’expérience a été répétée 3 fois et la moyenne des 3 valeurs obtenues a été définie comme pression supportée par la patte enflammée du rat (DELGADO L.O.E., 2006). 9 Une augmentation de la pression supportée par la patte enflammée du rat signifie que le produit testé possède un effet analgésique périphérique. L’inhibition de la perception de la douleur a été calculée suivant la formule (VOGEL G. H. et coll., 2002): Où : Pt : pression supportée par les animaux du lot témoin PT : pression supportée par les animaux du lot traité b- Etude de l’activité analgésique centrale L’effet analgésique central de l’extrait SKD88 a été évalué sur son effet vis-à-vis de la douleur provoquée par l’immersion de la queue du rat dans de l’eau chaude à 50°C ou test de « tail flick » . L’effet analgésique de l’extrait SKD88 a été évalué par rapport au temps de latence entre l’immersion de la queue dans l’eau chaude et la réaction de l’animal: retirement de sa queue hors de l’eau chaude. Un test préliminaire a été effectué pour sélectionner les rats à utiliser. La queue de l’animal a été marquée à 5 cm à partir de sa pointe (DEBASIS M. et coll., 2011; MANOJ K.C. et coll., 2012). Ensuite, le rat a été placé dans une cage individuelle au-dessus du bain contenant de l’eau chaude maintenue à 50°C dans laquelle sa queue a été immergée au niveau de la marque (SUBHAN N. et coll., 2008). Le temps écoulé avant que l’animal retire sa queue a été chronométré. Seuls les rats qui ont eu un temps de réaction inférieur ou égal à 5 secondes ont été considérés comme sensibles et retenus pour les tests (KAMBLE R. et coll., 2013). Les animaux retenus ont ensuite été répartis en 2 lots traités avec l’extrait SKD88 à la dose de 400 ou 800 mg/kg. L’extrait a été dissout dans de l’eau distillée et administré par voie orale dans un volume de 10 ml/kg (ADEYEMI O.O. et coll., 2004). Après 15, 30, 45, 60 et 90 minutes de l’administration de l’extrait, chaque rat a été de nouveau placé dans la cage individuelle et le bout de sa queue a été plongé dans l’eau chaude. Le temps de latence de sa réaction a été noté (KOUAKOU S. L. et coll., 2010). Le temps maximal de l’immersion de la queue du rat dans l’eau chaude a été fixé à 15 secondes pour éviter des dommages tissulaires (IDID S. Z. et coll., 1998; ABID M. et coll., 2013). 10 Une augmentation du temps de latence de réaction du rat vis-à-vis du stimulus thermique indique un effet analgésique central de l’extrait. L’inhibition de la perception de la douleur du produit testé a été déterminée suivant la formule (IDID S. Z. et coll., 1998) : Où : T : temps de latence de réaction des animaux du lot traité (en secondes). t : temps de latence de réaction des animaux du lot témoin (en secondes). 15 : temps maximal de l’immersion de la queue de l’animal dans l’eau chaude (15 secondes). 

EXPRESSION ET ANALYSE DES RESULTATS

Les résultats ont été exprimés en moyennes ± écart-types ( ± e.s.m). Pour chaque test, les données ont été analysées à l’aide du logiciel EXCEL. Les moyennes des valeurs obtenues chez les animaux traités avec l’extrait ont été comparées entre elles, et elles ont été comparées avec celle des animaux du lot témoin (CHING F. P. et coll., 2009), en utilisant le test « t » de Student Fisher avec un degré de signification fixé à p < 0,05.