Etudes chimiques et biologiques de Aloe macroclada et des fruits de Fragaria ananassa

Description botanique

C’est un arbre haut de 2 à 7 m suivant les régions dans lesquelles il pousse. Ses feuilles sont longues (environ de 8 à 15 cm), de couleur vert-pâle et de forme oblongue. Elles sont luisantes, vertes foncées au dessous, glabre et vertes plus pâles en dessous. C’est un arbre à fleurs solitaires, les pétales externes sont de couleur jaune- vert, épais et ovales tandis que les pétales internes sont petits.
Le corossol est un fruit large, ovoïde ou globuleux, il peut aussi se présenter en forme de cœur. Il mesure de 10 à 20 cm de long et 15 cm de large et son poids peut atteindre 1500 g.
La peau qui entoure la pulpe blanche est de couleur verte. Sa surface est couverte de pointes arquées qui noircissent à la maturité. Les graines sont petites et nombreuses, de couleur foncée. (CAVACAO et KERAUDEN, 1958).

Ecologie

La plante est largement distribuée dans les régions tropicales et subtropicales du monde à climat chaud et à 500 m d’altitude. Le corossolier affectionne les terres sablonneuses, profondes et un climat pluvieux et chaud. A Madagascar, il peut être cultivé le long de la côte Est mais on peut aussi le rencontrer au Nord Ouest et au Sud Ouest. (RAMIANDRAZAFY, 1994) ; (CAVACAO et KERAUDEN, 1958)

Notions de phytochimie

Définition

La phytochimie est la chimie des végétaux. C’est la science qui étudie la structure, le métabolisme et la fonction, ainsi que les méthodes d’extraction, d’analyse et de purification substances naturelles issues des plantes. Les molécules d’origine végétale proviennent des processus biochimiques présents dans les métabolismes de la plante. Ils peuvent être divisés en deux grandes classes dont les métabolites primaires et les métabolites secondaires. Le précurseur obligé de ces deux classes de métabolites sont les glucides. Formés en premier lieu au cours de la photosynthèse à partir du dioxyde de carbone et de l’eau, les glucides sont à la base de tous les composés organiques du monde vivant comme l’illustre la figure qui suit.

Métabolites primaires

Les métabolites primaires sont des molécules nécessaires à la survie de toutes les plantes, ils se retrouvent donc en quantité abondante dans toutes les espèces. Ce sont principalement les glucides, les lipides et les protéines. Ces biomolécules sont des polymères formés à partir des oses, des acides aminés et des nucléotides.

Métabolites secondaires

Les métabolites secondaires, par contre, ne participent pas directement au développement des plantes. Ils vont plutôt jouer des rôles particuliers comme intervenir dans les relations de la plante avec le milieu extérieur (stress écologiques, antibiotiques contre les microbes ou encore protections contre les ravageurs). En effet, ces molécules sont élaborées chez une espèce pour des fonctions bien spécifiques, par exemple une réponse de la plante à la suite d’un stress écologique. Les métabolites secondaires interviennent aussi dans la défense de la plante contre les prédateurs et les ravageurs ou encore pour attirer les insectes pollinisateurs. En quantité restreinte, ces substances sont élaborées dans les organismes vivants à partir des métabolites primaires comme les acides aminés et les hydrates de carbone par divers processus biologiques. (BRUNETON, 1999)
Les métabolites secondaires sont en très grand nombre et d’une variété structurale extraordinaire selon les espèces. Cette grande variété constitue une source inépuisable de molécules thérapeutiques naturelles utiles à l’Homme.
Les principaux types de métabolites secondaires sont :
– les alcaloïdes,
– les terpénoïdes,
– les composés phénoliques.

Les alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des molécules organiques ayant un cycle contenant un atome d’azote à état d’oxydation négatif et étant de véritables métabolites secondaires ou de distribution restreinte dans les organismes vivants (BRUNETON, 1999). Les alcaloïdes se trouvent rarement dans les fruits des végétaux. Ingérées à forte dose, les alcaloïdes sont toxiques mais lorsqu’elles sont attribuées à faible dose, ils sont doués de propriétés pharmacodynamiques significatives.

Ces substances possèdent notamment
– des effets antalgiques et anesthésiques ou narcotiques (morphine, atropine, …) ;
– activités antitumorales ou anticancéreuses (vinblastine, vincristine, ellipticine, …) ;
– activités antiparasitaires comme les antimalariques (cinchonine, quinine, …) ;
– activités antivirales ((-)-swainsonine, la (+)-castanospermine, désoxynojirimycine) ;
– activités antibactériennes ;
– ou même ils peuvent être des poisons mortels (strychnine, nicotine, coniine).
La classification des alcaloïdes se fonde sur leur biosynthèse et donc de l’origine de leurs squelettes carbonés ou structures de base qui les forment. Généralement, ils se forment à partir des acides aminés. On distingue principalement les alcaloïdes dérivés de l’ornithine et de la lysine, de la phénylalanine, de la tyrosine et ceux dérivés d’acides aminés aromatiques et les alcaloïdes terpéniques.
La figure suivante montre la structure de la coreximine, alcaloïde isolé des feuilles du corossolier (A. muricata).

Pouvoir antioxydant et antimicrobien

Activité antioxydante

Définition

Par définition, un antioxydant est une molécule qui diminue et/ou empêche l’oxydation d’autres substances chimiques. Présents à faible concentration comparée à celle du substrat oxydable, les antioxydants sont des substances qui retardent ou préviennent de manière significative l’oxydation de ce substrat. L’oxydation fait partie d’une réaction d’oxydo réduction qui transfère des électrons d’une substance vers un agent oxydant, une réaction normale chez tous les organismes vivants. Cette réaction produit des radicaux libres qui peuvent être neutralisés par certaines molécules que l’organisme élabore pour établir un équilibre. Cependant, la production non contrôlée de radicaux libres ; souvent causée par la pollution, le tabagisme, une mauvaise alimentation ou encore l’exposition prolongée au soleil, entraîne des réactions en chaîne destructrices. (LEHUCHER-MICHEL et al., 2001 ; POPOVICI, 2009 ; DARR et FRIDOVICH, 1994) Produits des métabolismes cellulaires, les radicaux libres sont instables et ils cherchent à retrouver leur stabilité en s’associant à d’autres molécules, et ce au détriment de l’environnement.

Activité antimicrobienne

Définitions

Un agent antimicrobien est une substance capable d’empêcher les cellules microbiennes à se développer (bactériostatique, fongistatique,…) ou capable de les tuer en un seuil déterminé (bactéricide, fongicide, virucide). Ces substances peuvent être secrétées par des microbes pour permettre la survie ou pour se défendre, par exemple la pénicilline.
Egalement, elles peuvent être extraites à partir de plantes. Ces dernières décennies, la résistance des microbes, surtout les bactéries, aux antibiotiques synthétiques a été reportée partout dans le monde. A cet effet, une recherche d’activité antimicrobienne dans les plantes médicinales et aromatiques qui renferment une grande variété de composés actifs est effectuée. Ainsi, de nombreuses substances issues de plantes sont utilisées pour leurs propriétés antimicrobiennes : huiles essentielles, extraits, oléorésines,… Ces substances nouvellement extraites peuvent inhiber ou tuer les microbes pathogènes à moindre toxicité. L’activité antimicrobienne d’une substance est donc appréciable à sa capacité à inhiber le développement des microbes ou à les tuer. Les paramètres étudiés dans l’évaluation quantitative de la propriété antimicrobienne d’une substance biologique ou chimique sont la bactériostasie et la bactéricidie. (CLSI, 2000)

Evaluation de l’activité antimicrobienne

Il y a plusieurs méthodes pour évaluer l’activité antimicrobienne des substances naturelles :

Méthode de diffusion sur gélose

Dans cette procédure, des disques de papier Whatman de 6 mm de diamètre contenant la substance à tester sont placés sur la surface d’un milieu de culture gélosé ensemencé par des souches microbiennes. Les boîtes de Pétri sont incubées selon les microorganismes et l’apparition d’un halo d’inhibition autour du disque montre la sensibilité de la souche microbienne.

Méthodes de dilution

Le principal avantage des méthodes par dilution est la possibilité d’estimer la concentration de la substance à tester inhibant le développement des microoganismes, pour cette raison, elles sont utilisées pour déterminer les CMI.
Dans la méthode classique, une rangée de concentrations de l’extrait est mélangée avec un milieu nutritif inoculé de la souche à tester. Après incubation, la plus basse concentration causant une inhibition de des microorgansimes correspond à la CMI. Pour la méthode microdilution, le principe est le même mais les tests se font avec des microplaques de 96 puits. L’inhibition des micrororganismes est déterminé par la turbidité de la suspension ou par un indicateur coloré (résazurine).

Méthode par TLC- DB

Le TLC-DB ou Thin Layer Chromatography – Direct Bioautography est une méthode dont le principe est similaire à celui utilisé pour la méthode de diffusion. La seule différence est que l’extrait à tester est d’abord développé sur une plaque CCM puis placé au fond de la culture en milieu gélosé. Des zones d’’inhibition apparaissent sur les tâches correspondant aux composés ayant un potentiel antimicrobien. (CHOMAI, GRZELAK, 2010)

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Principales substances antimicrobiennes

Il existe deux principales substances antimicrobiennes : les huiles essentielles et les antibiotiques.
Les antibiotiques, au sens strict, sont des produits élaborés par des microorganismes pour en tuer d’autres. Sont inclus dans cette catégorie les dérivés semi-synthétiques et les produits entièrement synthétiques mais souvent inspirés des substances naturelles. Ces molécules inhibent et même tuent de façon sélective les microorganismes sans causer d’effets toxiques sur les organismes supérieurs.
Les huiles essentielles sont produites comme métabolites secondaires par les plantes aromatiques. Plusieurs études ont effectivement montré un potentiel antimicrobien de ces substances (HAMMER et al., 1999). L’activité antimicrobienne des huiles essentielles est principalement fonction de leur composition chimique, en particulier de leurs composés volatils majeurs.

Travaux antérieurs

Les fraises sont très étudiées pour leurs activités antioxydantes in vitro et leurs composés phénoliques, molécules organiques réputées pour leur pouvoir antioxydant élevé. Les principaux composés phénoliques de la fraise sont la pelargonidine 3-glycoside, l’acide ellagique et les flavonoïdes (quercétine, kaempférol, …). (WANG et al., 2000 ; WANG et al., 1997). Il a été rapporté que les extraits de fraise possèdent une activité antioxydante 15 fois plus importante que le Trolox (antioxydant de référence) et que leurs composés phénoliques inhibent l’oxydation des LDL et des liposomes. (WANG et al., 1997 ; HEINONEN et al., 1998). Il a été aussi démontré que les composés antioxydants de la fraise retardent le déficit du système nerveux central observé chez les rats âgés. (BICKFORD et al., 1997)

Selon les études, il y a une corrélation positive entre la concentration en composés phénoliques totaux et l’activité antioxydante des fraises. (WANG et al., 2000) Ainsi, de nombreuses auteurs ont étudié l’effet de différents facteurs sur la capacité antioxydante et la teneur en composés phénoliques totaux de la fraise : les facteurs agricoles, l’environnement, l’ordre du fruit, période de plantation ou encore le génotype. (ANTTONEN et al., 2006)
Par exemple, la capacité antioxydante des fraises dépend de leur génotype (cultivars, variétés). D’une façon générale, les fraises sauvages possèdent une activité antioxydante beaucoup plus marquée que celles cultivées. (SCALZO et al., 2005 ; DOUMETT et al., 2011)
De la même manière, les facteurs agricoles et environnementaux influence la teneur en composés phénoliques et la capacité antioxydante des fraises. Il a été démontré que l’augmentation de la fertilisation (NPK) accroît la teneur en composés phénoliques d’une certaine manière.
Les fruits tertiaires sont beaucoup plus riches en composés antioxydants que les fruits secondaires et primaires. La teneur en flavonols des fraises varie considérablement en fonction des cultivars testés (ANTTONEN et al., 2006).

ETUDES EXPERIMENTALES

Préparation des extraits

Les paragraphes suivants expliquent la préparation des matériels végétaux ainsi que des extraits.

Matériels végétaux

Les matériels végétaux ont été préparés avant les extractions, les paragraphes ci-après vont présenter la préparation des échantillons à tester.

Feuilles de Aloe macroclada

Les feuilles de A. macroclada ont été collectées manuellement à Manandriana dans la Commune rurale de Manandriana Avaradrano le 21 Septemnbre 2013. Elles ont été lavées à grande eau avant d’être extraites. Pour pouvoir comparer les activités ainsi que la composition chimique probable du gel et de l’écorce de A. macroclada, nous avons préparé deux types d’extraits à partir de la plante : les extraits obtenus à partir des feuilles dépourvues de gel et ceux obtenus à partir des feuilles entières séchées. Les feuilles subissent des prétraitements (séchage, découpage, broyage, …).
Vu que la quantité de gel obtenu des feuilles collectées n’a pas été suffisante pour l’extraction au solvant, nous avons dû acheter du gel préparé à Analakely le 25 Septembre 2013. L’extraction du gel consiste à racler les deux parties fendues de chaque feuille, le gel est tout de suite recueilli dans un récipient puis protégé de la lumière solaire et de l’air.

Fruits de Fragaria ananasa

Les fruits mûrs et frais de Fragaria ananasa ont été achetés à Anosy le 7 Octobre 2013 au bon matin puis préparées au laboratoire dans la matinée même. Nous avons pris le soin de ne pas prendre des fraises qui ne sont pas très mûres puisque quasi-totalité des substances organiques a été transformée en sucre pendant la maturation du fruit. Des prétraitements sont nécessaires (équeutage, découpage) avant l’extraction proprement dite.

Fruits de Annona muricata

Les corossols ont été achetés à Andravoahangy le 06 Octobre 2013. Nous avons choisi les fruits qui n’ont pas totalement atteint leur maturité pour la même raison que précédemment.

Détection des tanins et polyphénols

Principe

Les tanins sont des composés polyphénoliques à saveur astringente. On distingue deux types de tanins : les tanins hydrolysables (polyesters de glucose et d’acide phénoliques) et les tanins non hydrolysables (ou proanthocyanidols condensés). La présence des tanins et des polyphénolse est révélée par l’emploi de réactifs qui provoquent soit une coloration caractéristique soit la formation d’un précipité. Les tanins et les polyphénols sont en général des composés antioxydants mais certaines molécules possèdent des propriétés antiseptiques ou anti-diarrhéiques. (MIBINDZOU MOUELLET, 2004 ; N’GUESSAN et al., 2009 ; BRUNETON, 1999).

Détection des saponines et saponosides

Principe

Les saponines sont des hétérosides à squelette stéroïdique ou triterpénique généralement toxiques (antihémétiques). Ils sont dissouts dans l’eau et forment une mousse après agitation permettant ainsi leur détection. La formation de mousse est due à la présence d’une partie hydrophile et hydrophobe dans leur structure. Ce sont des substances généralement toxiques pour les animaux à sang chauds : homéolytiques (MIBINDZOU MOUELLET, 2004 ; N’GUESSAN et al., 2009)..

Mode opératoire

Une masse de 1 g de poudre végétale ou son équivalent en extrait brut est agitée vigoureusement pendant 30 mn avec 10mL d’eau distillée dans un tube à essai. Le tube est placé verticalement pendant 10 mn. Si la hauteur de la mousse est supérieure à 3 cm et qu’elle persiste, l’extrait contient des saponines.

Mode opéraoire

Des extraits équivalents à 5 g de plante sont dissouts dans 15 mL d’eau distillée puis filtré. Le filtrat est extrait avec du benzène puis additionné de 2 mL de NaOH puis agité.
L’apparition d’une coloration rouge violacée indique la présence de quinones dans l’extrait. Le test des anthraquinones (test de BORNTRÄGER) est réalisé seulement sur la poudre de A. macroclada. La poudre végétale est macérée dans CHCl3 pendant 30 mn. La solution chloroformique est filtrée puis à 2 mL de cette solution est ajouté 1 mL de solution aqueuse de NH4OH 20%. La présence d’anthraquinones libres se traduit par une coloration rouge orangé ou rouge violacé da la phase ammoniacale.

Détection des coumarines

Principe

Ce sont des molécules possédant un ou plusieurs groupements phénoliques éthérifiés ou non. Les coumarines présentent une fluorescence caractéristique sous lumière UV. Certaines coumarines sont des agents antimicrobiens, antioxydants et photosensibilisants (MIBINDZOU MOUELLET, 2004 ; N’GUESSAN et al., 2009 ; BRUNETON, 1999).

Mode opératoire

Les extraits sont dissouts dans de l’eau distillée dans des tubes à essai. Dans la partie supérieure du tube est placé un papier imbibé d’une solution aqueuse de NaOH 20% (m/v). Une fluorescence nette de ce papier à la lumière UV indique la présence de coumarines. Cette mise en évidence ne correspond qu’à une indication et non une identification puisque d’autres composés présentent également une fluorescence aux rayons UV.

Etude des activités antimicrobiennes

Pour l’étude de l’activité antimicrobienne des extraits, la méthode de diffusion sur gélose a été utilisée. Les tests ont été faits au Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Partie I : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUES
I-1. Cadre général de l’étude
I-2. Description de A. macroclada
I-3. Description de F. ananassa
I-4. Description de Annona muricata L.
I-5. Notions de phytochimie
I-6. Pouvoir antioxydant et antimicrobien
I-7. Etudes antérieures
I-8. Analyses par CCM
PARTIE II : ETUDES EXPERIMENTALES
II-1 Préparation des extraits
II-2 Screening phytochimique
II-3 Etude des activités antimicrobiennes
II-4 Etude de l’activité antioxydante
II-5 Analyse par CCM des extraits actifs
PARTIE III : PRESENTATION DES RESULTATS ET INTERPRETATIONS
III-1. Extractions
III-2. Résultats des criblages phytochimiques
III-3. Résultats des tests antimicrobiens in vitro
III-4. Résultats des tests d’activité antioxydante des extraits
III-5. Analyse par CCM des extraits actifs
III-6. Composition chimique et utilisation empirique de A. macroclada
CONCLUSION GENERALE
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

Etudes chimiques et biologiques de Aloe macroclada et des fruits de Fragaria ananassa

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