INFLUENCE DU MODÈLE DE BRUIT

SOURCES DE BRUITS EN MICROSCOPIE DE FLUORESCENCE

Depuis leur invention en 1969, les capteurs photographiques CCD ont été utilisés pour détecter la faible fluorescence de marqueurs en microscopie optique. Au cours des quatre dernières décennies, ces dispositifs à transfert de charge, ou en anglais charge coupled device (CCD), ont été améliorés pour faciliter l’acquisition d’images à faible luminosité. Les principales caractéristiques qui ont contribué à ce progrès sont une efficacité quantique supérieure à 90%, un bruit de lecture avec un faible écart-type, un facteur de remplissage au voisinage de 100% et une excellente efficacité de transfert de charge [Waltham, 2013]. Cependant, les images numériques acquises à l’aide de ces détecteurs restent bruitées. Ces bruits viennent de différentes sources dont certaines sont liées au signal d’intérêt que l’on cherche à mesurer, d’autres n’en dépendent pas. Il est difficile de dresser une liste exhaustive des sources de bruits qui altèrent les images numériques acquises en microscopie optique. Cependant, les sources de bruits les plus courantes sont les suivantes. Le bruit de photons (aussi appelé bruit de grenaille) est une source de bruit inhérente à toute source lumineuse. Le signal de fluorescence mesuré, émis par un fluorophore après excitation, est une grandeur physique composée d’événements discrets : les détections de photons. Par sa nature, ce signal est donc aléatoire et peut être caractérisé par une loi de Poisson dont l’espérance mathématique et la variance sont proportionnelles à l’intensité du signal de fluorescence. Le bruit de fond est un signal de fluorescence endogène non désiré provenant de composésnaturels, tels que le tissu biologique. Cette autofluorescence se caractérise par un spectre d’émission large par rapport à ceux des fluorophores généralement étroits. Il est donc difficile, par des filtrages traditionnels, de la séparer du signal de fluorescence. Le bruit de fond se caractérise aussi par une loi de Poisson mais dont l’espérance mathématique et la variance ne dépendent pas du signal utile émis par le fluorophore. Le courant d’obscurité correspond au signal mesuré alors qu’aucune source n’éclaire le détecteur. Pendant la mesure, des porteurs de charges se créent par simple agitation thermique. Le signal à temps discret résultant de cette agitation est aléatoire et perturbe la mesure. Il peut être caractérisé par une loi de Poisson dont l’espérance mathématique et la variance ne dépendent pas du signal utile. Le bruit de lecture est une incertitude sur la mesure du courant électrique (image du flux lumineux). Il intervient lors de la conversion des électrons en une tension mesurable. Il est souvent modélisé par un bruit additif gaussien dont les paramètres sont indépendants du signal utile. De plus, pour une caméra CCD, ses caractéristiques sont identiques en chaque pixel. Le bruit de quantification intervient lors de la conversion analogique – numérique que subit le signal mesuré. On passe d’une tension analogique continue à un signal numérique avec un nombre fini de valeurs. Cette quantification introduit une erreur (ou un bruit) entre le signal quantifié et le signal source. Cette erreur est modélisée par une distribution uniforme qui dépend de la taille du buffer de quantification. Avec l’émergence de nouveaux détecteurs capables de réduire considérablement le courant d’obscurité, le bruit de lecture et le bruit de quantification, les sources de bruits dominantes en SMLM proviennent principalement du bruit de photons et du fond.

APPROXIMATIONS DU CRITÈRE D’OPTIMISATION DES MASQUES

Les images acquises sont ainsi décrites par un bruit de grenaille provenant du signal utile (i.e., la fluorescence de l’émetteur) et d’un fond constant de niveau moyen b (i.e., l’autofluorescence du milieu biologique). Le bruit total résultant est alors modélisé par une loi de Poisson dont la moyenne est la somme des moyennes de ces deux bruits : Prh si j ¯ ¯ ¯µ ψ,θ i j i = ³ N0µ ψ,θ i j +b ´si j si j ! exph − ³ N0µ ψ,θ i j +b ´i (4.1) où b désigne la valeur moyenne spatialement constante du fond par pixel. On rappelle que N0µ ψ,θ i j désigne la valeur moyenne du signal de fluorescence attendu au pixel (i, j) (voir l’Équation (3.5)) et que si j correspond au nombre de photo-électrons mesurés au pixel (i, j)

MASQUES DE PHASE BINAIRES ANNULAIRES OPTIMAUX

Considérons pour commencer, une plage de PdC telle que ψmax = 1λ. Nous optimisons par une recherche exhaustive des masques de phase binaires à L = 2 anneaux — caractérisés par un seul paramètre ρ1 — en fonction du rapport N0/b ∈ [8, 33; 400]. La Figure 4.1(a) représente le paysage d’optimisation des masques, i.e., les valeurs du critère J(ρ1) normalisé, en fonction du rayon ρ1 et du bilan photonique. Pour rappel, le critère est normalisé en divisant J(ρ1) par la valeur de la RBCR évaluée en ψ = 0 et ρ = 0. Sur ce paysage, nous remarquons qu’il existe, pour toutes les valeurs de N0/b, deux minima locaux qui évoluent respectivement autour de ρ1 = 0, 6 et 0, 8. La ligne blanche sur la Figure 4.1(a) représente le rayon ρopt du masque optimal en fonction du bilan photonique. On distingue clairement deux régimes différents. Le premier correspond aux valeurs de N0/b < 85, où la valeur optimale est ρ1 ‘ 0, 56. Cette valeur est très similaire à celle obtenue avec le Scénario B : ρopt = 0, 55 (i.e., lorsque N0/b ¿ 1 : tout à gauche du graphe). Le second régime correspond aux valeurs de N0/b > 85 : la valeur optimale y évolue entre ρ1 = 0, 81 et 0, 78. Ces valeurs sont similaires à celle obtenue dans le Scénario A : ρopt = 0, 76 (i.e., lorsque b = 0, pour de très grandes valeurs de N0/b sur la Figure 4.1(a)). Afin de mieux visualiser le paysage d’optimisation et son évolution en fonction du bilan photonique, la Figure 4.1(b) représente le critère J(ρ1) normalisé en fonction de ρ1 pour les Scénarios A, B (en trait plein) et différentes valeurs de N0/b (en pointillés). On remarque que ce paysage évolue continûment du Scénario B vers le Scénario A à mesure que le bilan photonique augmente. Notons par ailleurs que plus N0/b est grand, plus le paysage d’optimisation est plat, et les minima locaux principaux proches des uns des autres. L’effet de cet aplatissement sera discuté ultérieurement.