INFLUENCE DU MODÈLE D’IMAGERIE

LES objectifs de microscopes modernes offrent des conditions d’imagerie optimales pour une source lumineuse ponctuelle située immédiatement sous la lamelle couvreobjet (i.e., zp = zfocus = 0). Cependant, lorsque la source est située à quelques micromètres sous la lamelle, par exemple, dans le cas d’un émetteur situé en profondeur dans l’échantillon et en dehors du plan focal, ces conditions ne sont plus réunies. Une forte ouverture numérique et un indice de réfraction élevé du milieu d’immersion peuvent alors conduire à des aberrations sphériques — du troisième ordre ou plus — non négligeables. Les objectifs de microscope sont conçus avec une ouverture numérique et un indice de réfraction élevés pour améliorer leur résolution latérale. Il existe de nombreux modèles scalaires ou vectoriels, plus précis que celui introduit au Chapitre 3, qui tiennent compte de ces caractéristiques d’imagerie pour mieux décrire l’image d’un émetteur dans toute la plage de PdC. Nous pouvons donc nous interroger sur l’influence que pourrait avoir un modèle d’imagerie plus réaliste que celui utilisé jusqu’à présent sur l’optimisation des masques de phase. 

MODÈLES SCALAIRES ET VECTORIELS

Comme en témoignent les travaux de thèse d’Aguet [2009], la modélisation des PSF fait l’objet de nombreuses recherches. La Figure 5.1 hiérarchise les modèles les plus connus pour décrire la formation d’une image par un système optique en fonction de leur degré de précision (ou d’approximation). Nous avons : la tache d’Airy; le modèle d’approximation quadratique (AQ); le modèle de Gibson & Lanni (GL); celui de Richards et al. [1959]; et les équations de Maxwell. Nous distinguons ainsi deux catégories de modèles. Ceux dits « scalaires » (en bleu) qui s’appuient sur l’optique de Fourier pour calculer la réponse impulsionnelle spatiale du système d’imagerie, et les autres dits « vectoriels » (en vert) qui tiennent compte de la nature vectorielle du champ électrique. Les modèles scalaires décrivent généralement la PSF à l’aide des Équations (1.2) et (1.3) dont je rappelle ici l’expression 1 : hzp (x, y) ∝ ¯ ¯ ¯ ¯ FT2D £ ΠDisk exp¡ i Φzp ¢¤µ x NA |M|λ , y NA |M|λ ¶¯ ¯ ¯ ¯ 2 (5.1) avec λ la longueur d’onde de la lumière incidente, NA l’ouverture numérique objet du système d’imagerie et M le grandissement traversal. La fonction de phase pupillaire Φzp est donnée par : Φzp (r ) = 2π λ Wzp (r ) (5.2) où Wzp (r ) correspond à la différence de chemin optique, mesurée dans la pupille de sortie à la coordonnée radiale (normalisée) r ∈ [0; 1], entre la surface d’onde sphérique de référence et la surface d’onde réelle défocalisée. Ainsi les trois modèles scalaires mentionnés dans la Figure 5.1 correspondent à différentes expressions de Wzp (r ). Ces modèles ne prennent pas en compte la polarisation de la lumière. Or à des ouvertures élevés, les rayons entrant dans l’objectif sont très inclinés et il peut donc être nécessaire, pour certaines applications, de tenir compte du caractère vectoriel du champ 1. L’indice ∆zi a été remplacé par zp et l’ouverture numérique image NAi a été remplacée par NA/|M| (condition des sinus d’Abbe [Born et Wolf, 1999])  FIGURE 5.1 – Modèles les plus connus pour décrire la formation d’une image par un système optique en fonction de leur degré de précision ou d’approximation. Cette figure s’inspire de celle présentée dans les travaux de thèse d’Aguet [2009]. électrique pour calculer la PSF. Les fondements de cette approche ont été proposés par Richards et al. [1959] sur la base des équations de Maxwell, puis développés par Hell et al. [1993] et Török et Varga [1997]. Cependant, comme l’a montré Aguet [2009], pour de nombreuses applications — y compris celle de la super-localisation de molécules uniques — le modèle scalaire de Gibson et Lanni [1992] est suffisamment précis pour décrire la formation des images. Le modèle le plus simple est celui de la tache d’Airy. Il permet de décrire la réponse impulsionnelle spatiale d’un instrument optique d’ouverture circulaire et uniquement limité par la diffraction (i.e., sans défaut de mise au point). La différence de chemin optique Wzp (r ) est donc nulle et le système est entièrement décrit par l’Équation (3.3). En présence d’un défaut de mise au point (i.e., une aberration supplémentaire de défocalisation pure), l’approximation quadratique (AQ) introduite au Chapitre 1 à l’Équation (1.14) est couramment utilisée pour décrire la formation de l’image par le système optique.

DISTANCE DE TRAVAIL OPTIMALE

Pour correctement imager les fluorophores, il est nécessaire d’ajuster la distance de travail du microscope en fonction de la profondeur d’imagerie que l’on souhaite atteindre, et ce afin d’avoir une PSF la plus concentrée possible dans tout le volume imagé. Ce réglage est caractérisé dans le modèle AQ par la position longitudinale du plan focal, notée zfocus (voir l’Équation (5.3)), et dans le modèle GL par le paramètre d (voir l’Équation (5.4)). Ces deux grandeurs sont illustrées à la Figure 5.2. Notons [zmin, zmax] l’intervalle caractérisant la PdC souhaitée du système d’imagerie. 5.2.1. MODÈLE D’APPROXIMATION QUADRATIQUE (AQ) Avec le modèle AQ, l’évolution de la PSF en fonction de la défocalisation est entièrement caractérisée par le paramètre réduit ψ. Ajuster correctement la distance de travail du microscope revient donc à choisir la valeur de zfocus qui minimise la valeur FIGURE 5.2 – Construction associé à la définition du paramètre d. La position longitudinale du plan focal, notée zfocus, est ajusté en diminuant la distance entre l’objectif et la lamelle. La configuration nominale est telle que zfocus = 0. Pour obtenir zfocus > 0, il est nécessaire de s’écarter de cette configuration. Le paramètre d ≥ 0 caractérise cet écart. maximale de |ψ| lorsque la position longitudinale de l’émetteur zp varie dans l’intervalle [zmin, zmax]. Le réglage optimal est donc obtenu en plaçant le plan focal à mi-distance : z opt focus = zmax + zmin 2 . (5.6) La valeur maximale de |ψ|, notée ψmax, est donc atteinte en zmax et zmin et vaut : ψmax = NA2 4ns (zmax − zmin) . (5.7) Le paramètre de défocalisation ψ appartient donc à l’intervalle [−ψmax,ψmax] lorsque zp ∈ [zmin, zmax]. À titre d’illustration, la Figure 5.3(a) représente la variation du profil de la PSF en fonction de ψ, pour la configuration expérimentale décrite dans le Tableau 5.1. On note que par symétrie, une section transversale de la PSF le long de toute ligne passant par son centre est suffisante pour représenter l’ensemble de ses propriétés. L’axe vertical à gauche de la Figure 5.3(a) représente le paramètre de défocalisation ψ exprimé en unités de longueur d’onde λ de la lumière collectée, le graphique étant tracé pour ψ ∈ [−1, 5λ; 1, 5λ]. L’axe vertical à droite représente la position longitudinale zp de l’émetteur. La relation entre ψ et zp est celle exprimée à l’Équation (3.2) avec zfocus = z opt focus. On retrouve les résultats décrits au Chapitre 3, à savoir que plus l’émetteur est éloigné du plan focal (i.e., plus |ψ| est grand), plus la PSF s’étale et son lobe principal s’atténue. Cela limite considérablement la précision de localisation des émetteurs fluorescents éloignés du plan focal.