Mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la variabilité glycémique

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Fission

Le mécanisme de fission mitochondriale s’effectue par l’intermédiaire de plusieurs acteurs : les protéines Dynamin related protein 1 (Drp1), la protéine de fission mitochondriale (Fis1). Tout comme le mécanisme de fusion, le mécanisme de fission mitochondriale reste aujourd’hui peu connu. La protéine Drp1 est recrutée depuis le cytosol pour former une spirale autour de la mitochondrie, induisant la constriction des membranes externe et interne (Figure 14, d’après Elgass et al., 2013). Cette spirale se forme par fixation du GTP sur Drp1, qui induirait un changement de conformation de la protéine et une oligomérisation. L’hydrolyse du GTP fournirait ensuite l’énergie nécessaire à la constriction. Le recrutement de Drp1 se déroulerait par l’intermédiaire du facteur de fission mitochondrial (Mff) (Otera et al., 2010). Le rôle de la protéine Fis1 n’est pas encore clairement élucidé, mais sa surexpression induirait une fission plus importante des mitochondries. Elle est adressée à la membrane externe et serait impliquée dans le recrutement de Drp1 (Yoon et al., 2003). Les mécanismes de régulation de la fission mitochondriale sont en majeure partie contrôlés par des processus de phosphorylation ou ubiquitination de Drp1, dans le but de modifier son activité ainsi que sa localisation (Nakamura et al., 2006; Taguchi et al., 2007).

Rôles de la dynamique mitochondriale

L’un des rôles principaux de la dynamique mitochondriale est de maintenir l’intégrité et la distribution de l’ADN mitochondrial au sein des cellules, qui code pour des composants essentiels de la chaîne respiratoire (Jokinen and Battersby, 2013). La dynamique mitochondriale joue également un rôle dans les processus de division cellulaire. Lors de la transition G1-S du cycle cellulaire, les mitochondries passent d’un réseau fragmenté, à un réseau hyper-fusionné (Mitra et al., 2009). Le blocage de ce mécanisme d’hyper-fusion entraîne un arrêt de la progression du cycle en phase S, démontrant le rôle actif des processus de fusion/fission. Une altération de la dynamique mitochondriale engendrée par une inhibition de la protéine Drp1 (augmentant ainsi le rapport fusion/fission) provoque des dommages à l’ADN et une aneuploïdie (Qian et al., 2012).
Les mécanismes de fission participent également au recyclage des mitochondries, en permettant de séquestrer les composants endommagés à l’intérieur de mitochondries qui subiront ensuite un recyclage spécifique, la mitophagie. Le terme de mitophagie réfère à une autophagie sélective des mitochondries, proposé par Lemasters (Lemasters, 2005). Lorsqu’une mitochondrie subit ce processus, elle est ubiquitinylée sur des protéines appartenant à la membrane externe, notamment sur les mitofusines (Gegg et al., 2010), puis reconnue par des protéines spécifiques se liant à l’ubiquitine. Elle peut également exprimer des récepteurs spécifiques qui interagissent avec la protéine LC3 (microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3). La protéine LC3 est exprimée
à la membrane des autophagosomes, qui vont séquestrer les mitochondries pour dégradation.

Rôle de la mitochondrie dans la mort cellulaire

La morphologie du réseau mitochondrial et sa dynamique sont également impliquées dans les mécanismes de mort cellulaire programmée et non programmée, que sont l’apoptose et la nécrose.

Apoptose

L’apoptose est un processus de mort programmé par la cellule, faisant intervenir de nombreux acteurs moléculaires. Elle permet l’élimination de cellules endommagées ainsi que le maintien de l’homéostasie de l’organisme. L’apoptose peut être mise en place par deux voies d’activation : la voie intrinsèque faisant intervenir la mitochondrie, et la voie extrinsèque impliquant des récepteurs membranaires à domaines de mort (notamment le Tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) et le FAS/CD95) (Figure 15, d’après Youle and Strasser, 2008). Ces deux voies ont pour but d’activer des caspases dites initiatrices, qui par un processus en cascade, permettent aux caspases effectrices d’être activées.
La voie intrinsèque impliquant la mitochondrie est activée par des protéines pro-apoptotiques de la famille B cell lymphoma-2 (Bcl-2) telles que Bax et Bak. Ces protéines régulent la libération de facteurs pro-apoptotiques à travers la membrane mitochondriale externe vers le cytosol, tels que le cytochrome c ou l’Apoptosis inducing factor (AIF). Le relargage du cytochrome c dans le cytosol s’effectue en parallèle à un mécanisme de fission mitochondriale (Suen et al., 2008). Le mécanisme de fission lors de l’apoptose est dépendant de la protéine Drp1, qui est recrutée à la membrane mitochondriale externe. Elle serait impliquée dans la fragmentation mitochondriale et la libération du cytochrome c, et donc dans l’apoptose (Frank et al., 2001).
Après libération, le cytochrome c se fixe ensuite à une protéine adaptatrice apoptosis activating factor 1 (Apaf1). Une fois activée, le complexe cytochrome c/Apaf1 se lie à la pro-caspase 9 pour former l’apoptosome. La pro-caspase 9 est ensuite activée par protéolyse et va ensuite activer la caspase-3. La destruction de la cellule est engendrée par la caspase-3 qui clive certains substrats et active des DNases. Une fragmentation du noyau et du cytosquelette aura lieu, ainsi qu’une condensation de la chromatine, entraînant la formation de corps apoptotiques, qui seront par la suite dégradés.
Les processus apoptotiques sont régulés par de nombreux mécanismes, mais certains nécessitent la présence d’ATP (Kass et al., 1996). Lorsque les quantités d’ATP sont insuffisantes, les cellules vont mourir par nécrose.

Table des matières

Remerciements
Table des figures
Table des tableaux
Liste des abréviations
Introduction
I. Diabète
1. Définition
2. Diabète de type 1
3. Diabète de type 2
4. Complications liées au diabète
5. Importance du contrôle glycémique dans la réduction des complications du diabète
II. Variabilité glycémique
1. Définition
2. Evaluation de la variabilité glycémique
3. Contribution de la variabilité glycémique aux complications du diabète
4. Mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la variabilité glycémique
III. Mitochondrie
1. Structure
2. Fonctionnement énergétique
3. P􀆌odu􀄐tio􀅶 d’esp􀄟􀄐es 􀆌􀄠a􀄐tives de l’o􀇆􀇇g􀄟􀅶e
4. Dynamique mitochondriale
5. Rôle de la mitochondrie dans la mort cellulaire
6. Mitochondrie et hypoxie
Problématique du travail de thèse
Matériels et méthodes
I. Culture cellulaire
II. Traitement
III. Western blot
1. Extraction et dosages protéiques
2. Western blot
IV. Etude des fonctions mitochondriales
1. Polarographie (Rustin et al., 1994)
2. Activité des complexes de la chaîne respiratoire
3. P􀆌odu􀄐tio􀅶 d’ATP
4. Pote􀅶tiel de 􀅵e􀅵􀄏􀆌a􀅶e 􀅵ito􀄐ho􀅶d􀆌ial Δᴪm
5. Stress oxydatif.
6. Ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP)
V. Susceptibilité au développement de lésions hypoxiques
1. Ci􀅶􀄠ti􀆋ue d’h􀇇po􀇆ie
2. Libération de Lactate Déshydrogénase (LDH)
3. Dou􀄏le 􀄐olo􀆌atio􀅶 Hoe􀄐hst / B􀆌o􀅵u􀆌e d’􀄠thidiu􀅵 (BET)
VI. Analyses statistiques
Résultats
I. Signalisation cellulaire
1. Activité ERK 1/2, p38, Akt, GSK-3β
2. A􀄐tivatio􀅶 de l’autophagie
II. Fonctions mitochondriales
1. Respiration mitochondriale : phosphorylation oxydative
2. Activité enzymatique des complexes de la chaîne respiratoire
3. P􀆌odu􀄐tio􀅶 d’ATP
4. Potentiel de membrane mitochondriale
5. Ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale
III. Stress oxydatif.
1. Produ􀄐tio􀅶 d’a􀅶io􀅶s supe􀆌o􀇆􀇇des
2. Oxydation des protéines
IV. Sus􀄐epti􀄏ilit􀄠 à l’h􀇇po􀇆ie
1. Détermination de la mort cellulaire
2. Fonctions mitochondriales
3. Impact des fluctuations en glucose
Discussion
I. Choix du modèle et conditions de traitement
II. Signalisation et autophagie
III. Fonctions mitochondriales
IV. Mod􀄟le d’h􀇇po􀇆ie
Perspectives
Conclusion
Bibliographie
Annexes
Liste des communications
Liste des articles
Curriculum Vitae
Résumé/Abstract