Présentation des insecticides et traitement
Les molécules utilisées dans le traitement sont : un agoniste des ecdystéroïdes, le méthoxyfénozide (RH-2485) et un analogue de l’hormone juvénile, le pyriproxyfène.
Le méthoxyfénozide : Le méthoxyfénozide est le nom commun de N-tert-Bentyl-N-(3-methoxy-o-tolwoyl)-3,5-xylohydrazide. Sa formule empirique est C22H28N2O3 et son poids moléculaire est de 368, 47g. Il appartient à la catégorie des insecticides de groupe des bisacylhydrazines qui sont des agonistes de la troisième génération de l’ecdysone. Il agit principalement par ingestion chez les Lépidoptères. Il a été administré par application topique sur des chrysalides nouvellement exuviées aux doses : 0,004-0,008- 0,02 et 0,04 µg/insecte.
Le pyriproxyfène : 2-[1- metyl-2-(4-phenoxy-fenoxy) ethoxy ] pyridine, (Admiral 10EC CNCCC.JS). Sa formule empirique est : C20H29NO3, son poids moléculaire est de 321,5g et sa solubilité dans l’eau de 0,367 ppm. Le pyriproxyfène est un composé aromatique, volatile, relativement stable . Le pyriproxyfène a été utilisé in vivo par application topique sur des chrysalides nouvellement exuviées à quatre doses : 1,25- 2,50- 5 et 10 ng/ insecte.
Traitement combiné : L’efficacité de cette combinaison a été envisagée en traitement par application topique et deux séries ont été réalisées : Les chrysalides de la première série ont été traitées à l’exuviation (< 4 à 8 heures) avec le RH- 2485 à la dose 0,01µg (DI50) puis 24 heures après avec le pyriproxyfène à la dose 2,53 ng (DI50).
Les chrysalides de la deuxième série ont été traitées à l’exuviation avec le pyriproxyfène (2,53 ng), puis 24 heures après avec le RH-2485 (0,01 µg). Une quantité de 2µl a été déposée sur la face latéro-ventrale des chrysalides nouvellement exuviées. Les témoins ne reçoivent aucun traitement.
Microscopie électronique à transmission
L’épaisseur du chorion a été déterminée sur des coupes semi-fines préparées selon la technique de microscopie électronique à transmission, réalisée selon Karnovsky (1965) modifiée par Friend & Farquhar (1967). Les échantillons doivent passer par plusieurs étapes afin d’évité toute altération des tissus et assurer la stabilité de leurs structures macromoléculaires. Ces étapes sont : la fixation, le rinçage, la post-fixation, la déshydratation et l’inclusion.
Fixation, rinçage et post-fixation : Les ovocytes basaux prélevés des séries témoins et traitées sont immédiatement déposés dans des tubes eppendorf contenant du fixateur (paraformaldéhyde 5%, glutaraldéhyde 25%, sucrose et de tampon cacodylate 0,4 M ; pH 7,4). La fixation rend les cellules inaltérables, perméables aux colorants et permet de préserver leur structure macromolécuolaire. Si la fixation est prolongée (plusieurs semaines à 4°C), le rinçage sera également prolongé. Il se fait dans le mélange : cacodylate 0,4 M (10 ml), sucrose (12ml) et eau distillée (8 ml) avec deux bains de 20 minutes chacun et un troisième jusqu’au lendemain. Une post fixation est réalisée pendant une heure à température ambiante dans le mélange : tétroxyde d’osmium à 4% (2,5 ml), cacodylate 0,4 M (2,5 ml), sucrose et eau distillée (2 ml), pendant une heure. Le tétroxyde d’osmium fixe et stabilise les doubles couches lipidiques ainsi que les protéines tissulaires.
Déshydratation et l’inclusion : La déshydratation se fait dans des bains d’alcool éthylique à degrés croissants (30°, 70°, 95°, 100°) et se complète par un bain d’oxyde de propylène qui permet l’éclaircissement des pièces. A ce stade les échantillons sont encore mous pour être coupés et doivent être inclus dans un produit rigide qui est la résine dont la composition est la suivante : 60 ml de DDSA (dodecyl sulfate aldéhyde), 25 ml d’épikote et 20 ml d’araldite. Ce mélange est utilisé avec un accélérateur le DMP 30 [(2,4, 6-tris (dimithylamino -métthyl phénol)] à 4% pour polymériser la résine. Les échantillons doivent d’abord subir une imprégnation à la résine (trois bains sont réalisés à cet effet). Au terme de l’imprégnation, les échantillons sont inclus dans des moules munis de la référence remplis préalablement avec le mélange de résine additionné d’accélérateur. Enfin, les moules sont mis dans une étuve à 37°C pendant trois heures. Les pièces déplacées sont réorientées, et tous les moules sont remis dans une étuve à 60° pendant trois jours pour assurer la polymérisation de la résine.
Confection des coupes et coloration : Des coupes semi-fines sont réalisées au moyen d’un ultra microtome LKB 2088, en utilisant des couteaux on verre fabriqués à l’aide d’un Knife Maker LKB 7800. Elles seront montées sur des lames et colorées au bleu de toluidine (Borax de Na à 1% et bleu de toluidine à 1% dans l’eau distillée) pendant 3 à 5 min, puis examinées au microscope photonique pourvu d’un micromètre oculaire préalablement étalonné.
L’estimation de l’épaisseur du chorion des ovocytes basaux se fait au microscope photonique à l’aide d’un micromètre oculaire préalablement étalonné.
Dosage immuno-enzymatique des ecdystéroïdes
Principe du dosage : Le dosage enzymo-immunologique (EIA) est une technique qui a été adaptée aux ecdystéroïdes par Porcheron et al. (1989) puis modifiées par De Reggi et al. (1992). Cette technique utilise comme traceur enzymatique la péroxydase couplée à la 2- succinyle 20- hydroxyecdysone. Le traceur enzymatique est mis en compétition avec les ecdystéroïdes des extraits biologiques pour les sites d’un anticorps anti-ecdystéroïdes de lapin (anticorps primaire). Les complexes sont fixés par un second anticorps polyclonal anti-immunoglobuline de lapin (Jackson Immunoresearch) retenu sur une microplaque à 96 puits (NUCN Immunoplate Maxisorp F96, Danemark). Au bout de trois heures d’incubation, les éléments non retenus seront éliminés au cours d’un rinçage des plaques . Un réactif de révélation de la péroxydase, la tétramétyl benzidine au TMB (Sigma, France) est utilisé. Celle-ci se fait sous agitation pendant 15 à 20 minutes et les densités optiques sont mesurées à l’aide d’un lecteur de plaque (Labsystem, Finlande) à 630 nm sans ou avec addition d’H2SO4 (6 N), respectivement. La mesure de la quantité de la péroxydase fixé permet de déterminer la quantité d’ecdystéroïdes contenue dans les échantillons biologiques par comparaison avec une courbe de référence obtenue avec des solutions standard d’ecdysone (E).
Prélèvement des échantillons et extraction des hormones : Les chrysalides et les ovaires des séries témoins et traitées in vivo préalablement pesés, sont conservés dans des tubes eppendorf contenant 500 µl de méthanol. Après broyage aux ultrasons et centrifugation à 2700 tours pendant 10 minutes, le surnageant est récupéré et évaporé dans un bain-marie) sec réglé 60°C. Les extraits secs obtenus sont dissous dans 500 µl de tampon EIA (0,1 M ; pH= 7,4) et conservés au congélateur jusqu’au dosage.
Effet sur la morphométrie de l’ovaire
Chez les Lépidoptères comme E. kuehniella, l’ovaire est méroïstique polytrophique ; Il comprend 8 à 10 ovarioles et constituée par un tube épithélial mésodermique dans lequel les ovocytes sont en succession linéaire reflétant leur développement (William, 1971). On distingue dans chaque ovariole deux régions : le germarium et le vitellarium. Le germarium se différencie le premier, il contient des cellules germinales primordiales qui engendrent par division deux catégories de cellules sœurs, des ovocytes et des cellules nourricières ou trophocytes et des cellules somatiques (Cassier et al., 1997). Le vitellarium contient des ovocytes entourés par des cellules folliculaires, dont l’ensemble forme un follicule. Dans le vitellarium, les ovocytes accumulent des réserves nutritives (vitellus) et acquièrent des enveloppes protectrices appelées membrane vitelline et chorion (Rakhel & Dhadialla, 1992).
D’après les données acquises pendant notre expérimentation menée in vivo sur les femelles adultes d’E. kuehniella, nous avons constaté que le RH- 2485 et le pyriproxyfène administrés par application topique (DI 50) à l’émergence des chrysalides réduisent significativement le poids frais des ovaires et le nombre le nombre d’ovocytes. Ils réduisent également la taille et le volume de l’ovocyte basal.
Des perturbations de la morphométrie de l’ovaire avec le RH- 5849 et le RH-5992 sont également observées chez plodia interpunctella (Silhacek et al., 1990), S. littoralis (Smagghe et Degheele, 1992), Spodoptera exempta (Smagghe & Degheele, 1994c) et chez Choristoneura fumifirana (Retnakaran & Oberlander, 1993). Parmi les perturbations les plus importantes occasionnées par le tébufénozide, on note un retard dans la maturation ovarienne chez C. rosaceana et une dégénérescence des ovarioles (Renée et al., 2004). L’application du RH-5992 affect le développement ovarien de S. exiga et L. decemlineata et augmentent le pourcentage de résorption des ovocytes affectant ainsi la fécondation et l’éclosion des œufs (Smagghe & Degheele, 1994a). Des résultats similaires ont été rapportés par l’utilisation du RH-0345 et du RH-5992 qui réduisent le poids frais des ovaires, le nombre d’ovocyte par paire d’ovaire et la longueur de l’ovocyte basale chez les femelles d’E. Kuehniella (Hami et al., 2005 ; Khebeb et al., 2008). Ces mêmes effets morphométriques ont été observés chez T. molitor (Soltani-Mazouni et al., 2001, Taibi, 2007) et chez L. decemlineata après application topique du RH-0345 (Farinos et al., 1999).
Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1 : MATERIEL ET METHODES
1.1. Présentation du matériel biologique
1.2. Cycle biologique
1.3. Présentation des insecticides et traitement
1.4. Etude toxicologique
1.5. Etude morphométrique
1.6. Microscopie électronique à transmission
1.7. Potentiel reproducteur
1.8. Dosage immuno-enzymatique des ecdystéroïdes
1.9. Analyse statistique des données
CHAPITRE 2 : RESULTAT
2.1. Efficacité du méthoxyfénozide et du pyriproxyfène sur l’inhibition de l’exuviation adulte
2.1.1. Efficacité du méthoxyfénozide sur l’inhibition de l’exuviation adulte
2.1.2. Efficacité du pyriproxyfène sur l’inhibition de l’exuviation adulte
2.2. Effet in vivo du méthoxyfénozide et du pyriproxyfène appliqués seuls surmorphométrie de l’ovaire
2.3. Effet in vivo d’un traitement seul ou combinant le méthoxyfénozide et le pyriproxyfène sur l’épaisseur du chorion
2.3.1. Effet in vivo du méthoxyfénozide et du pyriproxyfène appliqués seuls sur l’épaisseur du chorion
2.3.2. Effet du traitement combiné sur l’épaisseur du chorion
2.4.Effet in vivo d’un traitement combinant le méthoxyfénozide et le pyriproxyfène sur le potentiel reproducteur
2.4.1. Effet méthoxyfénozide seul sur les évènements de la reproduction
2.4.2. Effet du pyriproxyfène seul sur les évènements de la reproduction
2.4.3. Effet in vivo du méthoxyfénozide et du pyriproxyfène en traitement combiné sur les évènements de la reproduction
2.5. Effet in vivo du méthoxyfénozide et du pyriproxyfène sur les ecdystéroïdes corporels
2.5.1. Effet vivo du méthoxyfénozide et du pyriproxyfène sur les ecdystéroïdes dans le corps entier
2.5.2. Effet du méthoxyfénozide et du pyriproxyfène sur la production in vivo d’ecdystéroïdes ovariens
2.5.3. Effet du traitement combiné sur la production in vivo d’ecdystéroïdes ovariens
CHAPITRE 3 : DISCUSSION
3.1. Etude toxicologique
3.2. Effet sur la morphométrie de l’ovaire
3.3. Effet sur l’épaisseur du chorion des ovocytes basaux
3.4. Effet in vivo sur le potentiel reproducteur
3.5. Effet sur les ecdystéroïdes
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
RESUMES
REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE : PRODUCTION SCIENTIFIQUE
