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Entérobactéries

Parmi les entérobactéries isolées, les bactéries du groupe K.E.S ont occupé la première place avec une fréquence très importante (92,98% des entérobactéries totales). Quant à E. coli, bactérie souvent rapportée comme responsable des infections nosocomiales, on a seulement isolé 05 souches (1,63%), tandis que des fréquences d’isolement élevées, ont été rapportées dans deux études nigériennes : 20,34% (Nwankwo, 2012) et 18,75% (Orji et al., 2005). La faible fréquence d’E. coli dans notre étude pourrait être expliquée par le fait que cette entérobactérie est beaucoup moins résistante à la dessiccation (Jawad et al., 1996; Wendt et al., 1998). Ainsi, E. coli peut survivre de 1,5 heure à 16 mois (Kramer et al., 2006).
Concernant le taux de détection de cette espèce dans notre travail, il a été négligeable (5/ 839 soit 0,6%) par rapport à celui trouvé par Ahoyo et al., (2007) qui était 11%.
En plus des espèces couramment isolées à l’hôpital, nous avons pu isoler d’autres espèces, qui sont rarement rencontrées en milieu hospitalier, il s’agit de Cedecea neteri et Ewingella americana qui peuvent être responsables d’infections chez des immunodéprimés.
 Ewingella americana
Ewingella americana est un BGN rare qui a été décrit pour la première, comme un nouveau genre dans la famille Enterobacteraciae, en 1983 par Grimont et al., (1983), à partir d’échantillons cliniques. E. americana a été isolé à partir de mollusques (Muller et al., 1995), de champignons (Inglis et Peberdy, 1996) et à partir de la viande emballée sous vide (Helps et al., 1999). Il a été identifié à partir de divers échantillons cliniques chez l’homme, y compris le sang (Pien et al., 1983; Pien et Bruce, 1986; Devreese et al., 1992; Maertens et al., 2001), les crachats (Ryoo et al., 2005), la conjonctive (Heizmann et Michel, 1991; Da Costa et al., 2000), les plaies (Bear et al., 1986), et le liquide péritonéal (Kati et al., 1999).
Dans plusieurs de ces cas, cette bactérie semblait survenir plus fréquemment chez les patients immunodéprimés, de ce fait, les cliniciens pourraient l’envisager comme un possible agent pathogène opportuniste (Pound et al., 2007). Cependant, des cas cliniques survenus aux personnes en bonne santé ont également été signalés. Partant de ce constat, les cliniciens pourraient envisager E. americana comme un vrai pathogène émergent (Syed et al., 2012).
E. americana provoque rarement des infections humaines, et son pouvoir pathogène est inconnu (Pien et al., 1983). De nombreux cas cliniques et épidémiques dus à cette entérobactérie ont été décrits : des conjonctivites (Heizmann et Michel, 1991; Da Costa et al., 2000), des péritonites (Kati et al., 1999), des pneumonies (Ryoo et al., 2005; Pound et al., 2007). Des septicémies (Devreese et al., 1992) et même la mort (Tsokos, 2003) ont également été rapportées. Pien et Bruce (1986) ont décrit une bactériémie, suite à une chirurgie cardiaque, elle a été liée à un bain de glace dans lequel les seringues utilisées pour la détermination du débit cardiaque, ont été conservées. Ainsi, Syed et al., (2012) ont récemment décrit une ostéomyélite et une arthrite septique chez un toxicomane utilisant des aiguilles non stériles pour injecter de l’héroïne par voie intraveineuse. Conformément à la littérature (Devreese et al., 1992) , la souche d’E. americana que nous avons isolé fermente le lactose, elle était également indole négative, citrate positive, ONPG positive, VP positive, glucose positive, mannitol positive.
E. americana est une bactérie peu exigeante et qui peut survivre dans l’eau et dans une solution de citrate et de préférence croît à 4°C (Syed et al., 2012). Notre souche est évidemment isolée d’un réfrigérateur dans un laboratoire. A partir de ce réservoir, E. americana peut contaminer les mains du personnel ou le matériel médical, et être par conséquent transmise à d’autres malades. Une pseudobactériémie a été décrite en 1987, à la suite d’une contamination croisée à partir de tubes de coagulation citratés, contaminés par E. americana, constituant ainsi un réservoir environnemental (McNeil et al., 1987). Donc, on peut considérer que le réfrigérateur est un réservoir environnemental pouvant être responsable d’une infection nosocomiale possible, en particulier en cas de non-respect des règles d’hygiène des mains (port de gants surtout) par les phlébotomistes au cours des prélèvements sanguins. Enfin, puisque peu d’informations existent sur la niche écologique de cette bactérie (Syed et al., 2012), le respect des règles d’hygiène est donc indispensable pour prévenir les infections à E. americana.
 Cedecea neteri
Dans notre travail, on a isolé une seule souche de C. neteri dont les caractères biochimiques sont identiques à ceux décrits par Farmer et al., (1982), sauf que notre souche a été gélatinase (+).
Les bactéries du genre Cedecea ont rarement été isolées chez l’homme et leur pouvoir pathogène est mal connu. La plupart ont été isolées de secrétions bronchiques (Delmas, 2003). Le premier cas de bactériémie humaine due à une souche de C. neteri a été rapporté par Farmer et al., (1982) où les constatations ont appuyé une origine acquise dans la communauté plutôt à une infection nosocomiale.
Dans une autre étude, Aguilera et al., (1995) ont décrit un cas de bactériémie due à C. neteri chez un patient atteint de lupus érythémateux disséminé (LED), qui a conduit à sa mort.
C’était probablement une infection nosocomiale chez ce patient immunodéprimé, parce qu’il est bien connu que les patients atteints de LED, en particulier ceux soumis à un traitement immunosuppresseur à long terme, sont prédisposés à des infections graves. On sait très peu sur le rôle de Cedecea dans les maladies humaines, et cet agent peut avoir le statut comme un pathogène opportuniste (Aguilera et al., 1995).

Les bacilles Gram négatifs non fermentaires

Les bacilles à Gram négatif non fermentant sont les bactéries les plus souvent isolées chez les patients atteints de mucoviscidose au stade chronique. La plupart des études épidémiologiques ont montré la nette prédominance de P. aeruginosa, suivi de B. cepacia, S. maltophilia et Alcaligenes (Achromobacter) xylosoxidans. Ces bactéries ont un pouvoir pathogène et une capacité de transmission variable, rendant importante leur identification au niveau de l’espèce pour la prise en charge de ces patients. Les BGNnF sont généralement considérés comme des pathogènes opportunistes qui ont été sélectionnés par des traitements antibiotiques anti- Pseudomonas répétés et prolongés (Ferroni et al., 2003).
Dans notre étude, P. aeruginosa, représente l’espèce la plus fréquemment isolée parmi les BGNnF, avec un taux de 58,33% (Figure 15), ce taux est inférieur à celui rapporté par Liazid (2012) qui a trouvé 71,42%. En revanche, nous avons également constaté une faible fréquence de l’espèce A. baumanii, qui était de 5%. Cette fréquence est inférieure à celle rapportée par Liazid (2012) qui était 28,57%. Quant aux autres BGNnF, S. maltophilia et B. cepacia ont été respectivement isolées à des fréquences de l’ordre de 16,67%, et de 20%.
Figure 15 : Répartition des BGN nF en fonction des espèces
En ce qui concerne le taux de détection d’A. baumanii, il a été très faible (00,35%) par rapport à celui rapporté par Liazid (2012), qui était 6,06% (2/33 prélèvements). Pour P. aeruginosa, le taux de détection est relativement plus élevé (4,17%) que celui d’A. baumanii, cependant il reste inférieur au taux de détection rapporté par Liazid (15,15% soit 5/33 prélèvements), et à celui trouvé par Fazeli et al., (2012), qui était 36,28% (41/113 prélèvements). L’isolement fréquent dans ce dernier cas, pourrait être en rapport avec des bouffées épidémiques au cours desquelles est impliquée la forte contamination de l’environnement des patients porteurs. Néanmoins, notre résultat est comparable à celui rapporté dans une étude faite sur l’environnement des enfants atteints de mucoviscdose (Mouterde et al., 1995), et qui était de 5,5%.

Pseudomonas aeruginosa

Le bacille pyocyanique est une bactérie de l’environnement mais peut être commensal du tube digestif. Pour les sujets en bonne santé, P. aeruginosa est peu fréquent, avec seulement 2 à 10 % de porteurs tandis que chez les sujets hospitalisés ce taux peut atteindre 50 %, voire 60% sur les plaies de brûlures ou d’escarres (Floret et al., 2009). Les principaux sites de portage étant le tube digestif, les voies aériennes supérieures et la peau (Bertrand et al., 2003).
Depuis l’émergence de cette espèce en tant que pathogène opportuniste majeur, de nombreuses épidémies hospitalières ont été décrites. Le plus souvent les investigations menées au décours de ces épidémies identifiaient l’environnement hydrique des services comme réservoir principal de contamination des patients. Saprophyte des environnements humides, P. aeruginosa peut en effet survivre et se multiplier sur des supports inertes humides (lavabos, robinets, savons, nébuliseurs et humidificateurs des appareils de ventilation), voire des solutions antiseptiques conservées trop longtemps (ammoniums quaternaires, chlorhexidine). De plus, les études disponibles montrent très majoritairement que les infections à P. aeruginosa acquises en réanimation sont des infections tardives (survenant plus de cinq jours après l’admission), présumant ainsi de l’acquisition de la souche dans le service considéré (Floret et al., 2009).
Dans notre travail, P. aeruginosa est parmi les espèces les plus représentées, la fréquence d’isolement est de 11,44%, elle est inférieure à celle trouvée par Jalalpoor (2011) qui était 19,44%. La fréquence élevée de cette espèce pourrait être en partie expliquée par le fait qu’elle peut résister aux désinfectants couramment utilisés en milieu hospitalier (Orji et al., 2005).
Nous avons isolé P. aeruginosa dans plusieurs sites humides particulièrement les lavabos. L’isolement de P. aeruginosa dans les lavabos est attribuée à la formation de biofilm, qui permet une fixation stable aux surfaces et une protection de la désinfection (Lowe et al., 2012). En plus des lavabos, nous avons isolé P. aeruginosa dans d’autres réservoirs humides comme les toilettes, les siphons, les robinets, les solutions antiseptiques (Bétadine et alcool).
En outre, nous avons même isolé cette bactérie à partir des surfaces sèches (sols et lits), de l’équipement (pèse-bébé, respirateurs), de différents tissus (blouses, draps, oreillers) ainsi que de l’air.
Toutefois, la fréquence d’isolement de P. aeruginosa, est géographiquement variable dans notre étude. Parmi 35 souches de P. aeruginosa, 11 (31,43%) souches viennent des services de réanimation. Ceci revient d’une part aux pratiques thérapeutiques appliquées en milieu de réanimation, telles la pose de cathéters et de sondes, l’utilisation de respirateurs etc… (Chabaa et al., 2000). D’une autre part, cette espèce occupe une place prépondérante dans les infections nosocomiales en milieu de réanimation (Bercault et al., 1994), où elle joue un rôle majeur dans les infections broncho-pulmonaires et à un degré moindre dans les infections urinaires et les bactériémies (Floret et al., 2009). Dans les services de réanimation, P. aeruginosa a été rapporté comme le microorganisme le plus fréquent (18 %) qui semble survivre particulièrement bien dans les milieux humides, notamment les points d’eau (mousseurs et siphons) d’où l’intérêt de la désinfection régulière des points d’eau (Lashéras et al., 2006).
La nature, exogène ou endogène, des sources de contamination par P. aeruginosa, est encore très discutée. Pour certains auteurs, l’origine endogène semble prédominer comparativement à l’acquisition exogène par transmission croisée. En fait, de 2 à 10 % de patients sont fréquemment admis en étant porteurs asymptomatiques de P. aeruginosa qui vont développer ensuite une infection à l’occasion de leur hospitalisation dans un service de soins intensifs ou de réanimation. Pour d’autres auteurs, les sources exogènes semblent prédominantes (Adjidé et al., 2010).
Dans une étude récente, Floret et al., (2009) ont suggéré que l’épidémiologie de P. aeruginosa est diversifiée, et trois points importants sont mis en évidence par l’analyse de la littérature. Premièrement, il s’agit non seulement d’un pathogène opportuniste mais aussi d’un commensal opportuniste, certains groupes de patients étant fréquemment « porteurs sains » de cette bactérie, ces patients développant ensuite une infection à l’occasion de leur hospitalisation dans un service de soins intensifs. Deuxièmement, il y a une transmission directe, manuportée de patient à patient dans les services de réanimation, indépendante de l’exposition du patient à l’environnement inerte (points de distribution d’eau). Troisièmement, il y a néanmoins un rôle indiscutable de l’environnement hydrique dans le risque de colonisation hospitalière des patients. Ces observations nous montrent qu’une part non négligeable des cas d’acquisition de P. aeruginosa en réanimation est probablement évitable à la fois par un respect strict de l’hygiène des mains et une maîtrise de la contamination des points d’eau.
Dans ce contexte, il a été rapporté que P. aeruginosa est extrêmement difficile à déloger d’un réseau d’eau, et donc de la robinetterie. Donc, la prévention des infections à P. aeruginosa, d’origine environnementale, repose sur une maîtrise du risque microbiologique associé à l’environnement hydrique hospitalier. Pour cela, il faut choisir une robinetterie facile à entretenir et réduire le niveau de biocontamination , avec une utilisation rigoureuse de solutés hydro-alcooliques, ce qui permet d’éviter le transfert de ces germes entre environnement et patient comme entre patients (Adjidé et al., 2010).

Acinetobacter baumanii

A. baumannii est un BGNnF présent dans l’environnement et commensal des muqueuses de l’homme. Depuis quelques années, ce germe est considéré comme un pathogène opportuniste responsable d’un taux croissant d’infections nosocomiales sévères causant de réelles difficultés thérapeutiques du fait de sa capacité à développer plusieurs mécanismes de résistances aux antibiotiques. La diffusion épidémique est attribuée à la transmission manuportée et à la survie prolongée du germe dans l’environnement hospitalier (Lahsoune et al., 2007). Acinetobacter spp est l’un des agents pathogènes capables de survivre dans des réservoirs hospitaliers et pour lesquels la contamination de l’environnement peut jouer un rôle dans l’acquisition nosocomiale (Weber et al., 2010). Acinetobacter spp. peut persister de 3 jours à 5 mois (Kramer et al., 2006). Dans certaines conditions, des espèces d’Acinetobacter peuvent survivre pendant 4-5 mois ou plus sur des surfaces sèches (Otter et al., 2011).
De nombreuses études ont rapporté la prédominance des infections dues à A. baumanii dans des services de réanimation. Les principaux facteurs de risque dans ces services reconnus dans la littérature sont : la ventilation assistée, l’antibiothérapie à large spectre, la durée de séjour prolongée, le cathétérisme artériel et la sévérité de la pathologie sous-jacente. Par ailleurs, le développement de techniques de réanimation et d’explorations invasives a largement contribué à la recrudescence des infections à A. baumannii dans ces services (Lahsoune et al., 2007). Dans notre étude, seulement trois souches d’A. baumannii ont été isolées, exclusivement du service de réanimation. Ce résultat se concorde avec les données d’une étude marocaine décrivant l’importance de cette espèce surtout en unité de soins intensifs (Elouennass et al., 2003). Une souche a été isolée à partir de l’air et deux souches à partir des oreillers. En effet, il a été démontré qu’une humidité relative plus élevée favorise la survie d’A. baumannii (Weber et al., 2010). La contamination environnementale étendue par Acinetobacter a été démontrée dans de nombreuses épidémies. Les sites colonisés incluent les barrières de lit, les tables de nuit, les surfaces des ventilateurs, les éviers, l’équipement d’aspiration, les matelas, l’équipement de réanimation les rideaux, les élingues de levage du patient, les vadrouilles, les seaux, les poignées de porte, les stéthoscopes, les incubateurs, et les claviers d’ordinateur. La colonisation des équipements et des dispositifs des voies respiratoires a été courante. La fréquence de la contamination de l’environnement dans des situations épidémiques a été rapportée de 3% à 50%. La colonisation des mains du personnel soignant avec Acinetobacter a également été démontrée, où elle peut survivre sur le bout des doigts pour les 60 minutes (Weber et al., 2010).
Dans notre travail, la fréquence d’isolement d’A. baumannii est trop faible (00,98%). Ainsi, le taux de contamination environnementale par cette bactérie est presque négligeable (3/839 prélèvements soit 0,36%). Ce taux est nettement inférieur à celui rapporté par Thom et al., (2011) qui était 9,8%. Cette différence pourrait être le fait que, dans cette dernière étude, les prélèvements ont été réalisés, à partir des surfaces environnantes de patients colonisés ou infectés par des A. baumanii multi résistants, c-à-d au cours d’une épidémie. Par ailleurs, une grande variation de la fréquence de contamination de l’environnement a été rapportée, entre différentes études, elle peut être expliquée par plusieurs facteurs, y compris la cultivabilité du microorganisme, le degré d’excrétion par le patient, la méthode d’échantillonnage et la facilité de contamination ou la difficulté de nettoyage de l’environnement. Les différences méthodologiques dans la collecte et la culture des échantillons rendent les comparaisons entre les études, difficile, et dans certains cas le niveau réel de la contamination environnementale peut être sous-estimé (Otter et al., 2011).

Table des matières

INTRODUCTION
PARTIE I : Revue bibliographique
CHAPITRE I : L’environnement hospitalier
1. Définition de l’environnement hospitalier
2. Les micro-organismes présents dans l’environnement hospitalier
3. Survie des micro-organismes dans l’environnement
4. Contamination de l’environnement par les micro-organismes
4.1. L’eau
4.2. L’air
4.3. Les surfaces
5. Zones à risque à l’hôpital
6. Place de l’environnement hospitalier dans la chaîne épidémiologique
7. Rôle de l’environnement dans la survenue des infections nosocomiales
7.1. Environnement et infections nosocomiales épidémiques
7.2. Environnement et infections nosocomiales endémiques
CHAPITRE II : Bacilles Gram négatifs responsables des infections nosocomiales
1. Entérobactéries
1.1. Escherichia coli
1.2. Salmonella
1.3. Klebsiella-Enterobacter-Serratia
1.3.1. Klebsiella
1.3.2. Enterobacter
1.3.3. Serratia
1.3.4. Pouvoir pathogène du groupe K. E. S
1.4. Proteus-Providencia
1.5. Citrobacter
2. Bacilles Gram négatifs non fermentaires
2.1. Caractères généraux
2.2. Sources et réservoirs des BGNnF en milieu hospitalier
2.3. Pseudomonas
2.3.1. Pseudomonas aeruginosa
2.4. Acinetobacter
2.5. Burkholderia cepacia
2.6. Stenotrophomonas maltophilia
3. Aeromonas
CHAPITRE III : Résistance aux antibiotiques des bacilles Gram négatifs
1. Résistance aux antibiotiques
1.1. Définition
1.2. Types de résistance
1.2.1. Résistance naturelle
1.2.2. Résistance acquise
1.3. Niveaux de résistance
1.4. Mécanismes de Résistance
1.5. Phénotype de résistance
2. Résistance des entérobactéries aux antibiotiques
2.1. Entérobactéries et ß-lactamines
2.1.1. Définition et classification des β-lactamases
2.1.2. β-lactamases à spectre élargi
2.1.3. Diversité des types de BLSE
2.1.4. Résistances naturelles
2.1.5. Résistances acquises
2.2. Entérobactéries et aminosides
2.3. Entérobactéries et quinolones
3. Résistance des BGNnF aux antibiotiques
3.1. Pseudomonas aeruginosa
3.1.1. Résistance aux β-lactamines
3.1.1.1. Phénotypes de résistance
3.1.1.2. Mécanismes de la résistance acquise
3.1.2. Résistance aux aminosides
3.1.3. Résistance aux fluoroquinolones
3.2. Acinetobacter baumannii
3.2.1. Résistance aux β-lactamines
3.2.1.1. Résistance naturelle
3.2.1.2. Résistance acquise
3.2.2. Résistance aux aminosides
3.3. Burkholderia cepacia
3.4. Stenotrophomonas maltophilia
3.4.1. Résistance aux β-lactamines
3.4.2. Résistance aux aminosides
3.4.3. Résistance aux fluoroquinolones
4. Aeromonas hydrophila
4.1. Résistance naturelle
4.2. Résistance acquise
PARTIE II : Matériel et méthodes
1. Cadre de l’étude
2. Réalisation des prélèvements
3. Isolement
4. Purification
5. Conservation des souches
6. Identification biochimique
6.1. Test d’oxydase
6.2. Identification biochimique par la galerie API20E
6.3. Identification biochimique par la galerie API20NE
6.4. Recherche des pigments spécifiques de Pseudomonas
7. Etude de la sensibilité aux antibiotiques
8. Recherche phénotypique des BLSE
8.1. Test de synergie
8.2. Test du rapprochement des disques
8.3. Test du double disque
9. Détermination des concentrations minimales inhibitrices
10. Extraction de l’ADN plasmidique
10.1. Extraction par la lyse alcaline
10.2. Qualité et quantification de l’extrait
11. Electrophorèse en gel d’agarose
12. Caractérisation des souches productrices de BLSE
12.1. Transfert des gènes de résistance par conjugaison
12.2. Amplification des gènes de résistance par PCR
PARTIE III : Résultats et discussion
1. Isolats bactériens
1.1. Aspect macroscopique des isolats
1.2. Aspect microscopique
2. Identification biochimique
2.1. Répartition des souches en fonction du groupe de BGN
2.2. Répartition des souches en fonction du genre
2.3. Répartition des souches en fonction des espèces
2.3.1. Entérobactéries
2.3.2. Les bacilles Gram négatifs non fermentaires
2.3.3. Autres BGN
2.4. Répartition des souches en fonction des services
2.5. Répartition des souches en fonction de l’origine du prélèvement
2.6. Répartition des souches par catégories de sites
2.7. Relation entre la qualité du nettoyage ou de désinfection des services, la contamination bactérienne environnementale et les infections nosocomiales
3. Etude de la sensibilité aux antibiotiques
3.1. Entérobactéries
3.1.1. Klebsiella pneumoniae
3.1.2. Escherichia coli
3.1.3. Ewingella americana
3.1.4. Cedecea neteri
3.2. Bacilles Gram négatifs non fermentaires
3.2.1. Pseudomonas aeruginosa
3.2.2. Acinetobacter baumanii
3.2.3. Stenotrophomonas maltophilia
3.2.4. Burkholderia cepacia
3.3. Autres bacilles à Gram négatif
3.3.1. Aeromonas hydrophila
3.3.2. Pasteurella pneumotropica
3.3.3. Vibrio fluvialis
4. Bacilles à Gram négatif multirésistants
4.1. Répartition des bacilles Gram négatifs multi résistants en fonction des services
4.2. Contamination des sites par les bacilles Gram négatifs multi résistants
5. Entérobactéries productrices des BLSE
5.1. Résultats des tests de détection des BLSE
5.2. Répartition des EBLSE selon les espèces
5.3. Répartition des EBLSE selon les services
5.4. Répartition des EBLSE selon les sites
5.5. Contamination des lavabos par les EBLSE
5.6. Résistance aux antibiotiques des souches EBLSE
6. Etude moléculaire
6.1. Détermination des supports génétiques de la résistance aux antibiotiques
6.2. Transfert de la résistance et analyse des plasmides
6.3. Détection des gènes codant pour la production des BLSE
6.4. Recherche moléculaire de la résistance associée
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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