L’ETUDE GENETIQUE DU CANCER DU SEIN CHEZ LA FEMME SENEGALAISE PAR LA PCR-RFLP

MATERIEL BIOLOGIQUE 

Le matériel biologique utilisé pour cette étude est obtenu par chirurgie chez les patients atteints de cancer du sein. Le prélèvement est fait par les médecins de l’hôpital Aristide le DANTEC de Dakar spécialisés dans ce domaine. Les tissus cancéreux comme les tissus sains collectés font l’objet d’une analyse moléculaire. Le but est de proposer une technique rapide et fiable dans l’identification de gènes pouvant être impliqués dans le cancer du sein puisqu’on parle jusqu’à présent de gène de susceptibilité. Ce qui laisse entendre que la totalité des gènes impliqués dans le cancer du sein n’est pas encore connues. Ainsi le gène du Cytochrome b qui est un gène mitochondrial codant est ciblé. Son choix repose sur le fait que c’est un gène qui code des protéines et que les mutations sur ce gène sont conservées. Il faut ajouter à cela le fait qu’il soit un gène à transmission maternelle, hautement polymorphe avec absence de recombinaison et sur tout facile à manipuler. 

EXTRACTION D’ADN 

L’extraction d’ADN est une technique permettant d’isoler l’ADN des cellules. Il existe différents protocoles d’extraction d’ADN. Celui utilisé est la méthode du Qiagen (DNeasy Tissue Kit). Avant l’extraction de l’ADN proprement dite, il y a d’abord la lyse cellulaire qui consiste à libérer l’ADN des ceJiules. Cette étape se fait à l’aide du tampon de lyse {l80J.Ll d’A TL) contenant des détergents. L’ajout de 20~.Ll de protéinase sert de dégradation de toutes les protéines, après une incubation à 55°C pendant 3h. Les débris tissus sont éliminés après centrifugation rapide et récupération du surnageant. L’étape suivante consiste à ajouter du tampon AL (200 J.Ll), à vortexer immédiatement, puis à incuber les échantillons à 70°C pendant 10 min.  s’en suit une addition de 200 J.LI d’éthanol 96-l 00%. Le mélange est ensuite vortexé et transvasé sur une colonne, puis centrifugé à 13 000 rpm pendant 1 min pour retenir l’ADN au niveau de la membrane de la colonne. En effet l’ADN chargé négativement se fixe, par interactions ioniques, sur la membrane de silice chargée positivement. A l’inverse, les protéines, les lipides et les polysaccharides sont éliminés. L’ADN fixé sur la colonne est ensuite lavé pour éliminer toutes traces de contaminant. Ce lavage est réalisé par ajout successif de deux tampons A Wl et A W2 (500 J,Ll chaque) qui passent à travers la membrane par centrifugation à 13 000 rpm pendant respectivement 1 min et 3min. La colonne est placée sur un tube de 1,5 ml et on ajoute le tampon d’élution AE (30 ~1) directement sur la membrane. Après incubation à température ambiante pendant 1 min, une centrifugation à 13 000 rpm pendant 1 min permet de décrocher l’ADN de la membrane et de le récupérer pour les analyses génétiques. L’ADN pur extrait est conservé à -20°C. 

MIGRATION ELECTROPHORETIQUE ET VISUALISATION DES FRAGMENTS DEL’ ADN. 

L’électrophorèse permet la séparation des fragments d’ADN en fonction de leur taille sur une matrice solide (gel d’agarose) soumis à un champ électrique. Les molécules d’ADN chargées négativement, migrent vers le pôle positif (anode) de la cuve électrophorétique de migration. Cette migration est fonction de la taille des fragments ADN. Plus elles sont grandes et moins la migration des fragments est faible dans le gel, et inversement les plus petits fragments auront la distance de migration la plus importante. La migration est faite toujours : après l’extraction d’ADN afin d’évaluer la qualité d’extraction et ou la quantité de l’ADN extrait,  après la PCR pour vérifier la qualité de celle-ci c’est-à-dire s’il y a réellement amplification du gène ciblé et en fin après digestion du produit PCR pour voir s’il y a digestion.Après extraction , 5 ~1 d’extrait d’ADN de chaque échantillon + 2 ~1 de bleu de broméphénol (bleu de charge), sont déposés sur un gel d’agarose 1,5% et mis dans une cuve à électrophorèse dans laquelle ils seront soumis à un courant électrique de IOOV pendant 20min. ce gel est ensuit placé dans un récipient contenant une solution de bromure d’éthidium (BEl) pendant 15min . L’ADN est révélé par le BET, un colorant fluorescent qui s’intercale entre les brins d’ADN, les rendent facilement détectable sur une table à UV. La taille de l’ADN est évaluée à l’aide d’un marqueur de poids moléculaire (ou de taille) qui est composé de plusieurs fragments d’ADN de tailles connues. Il est déposé dans le gel et migre en même temps que les échantillons et la distance de migration est mesurée à partir du puits de dépôt Le nombre de paire de base est donné en valeur approximative. Pour la migration des produits PCR et digestion, le protocole est presque le même à la seule différence qu’on n’y ajoute pas du bleu de charge utilisé pour augmenter la densité de l’ADN (afin qu’elle reste au fond des puits lors du dépôt) et la quantité déposée est soit ~ 10 J • .d. 

 LA PCR-RFLP 

La PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restricted Fragment Lengbt Polymorphism ou polymorphisme de longueur des fragments de restriction de produit PCR) est une technique mise au point par Karry Mullis en 1983. Aujourd’hui, c’est une technique incontournable et couramment utilisée en routine dans les laboratoires. La PCR-RFLP est une réaction enzymatique qui permet de sélectionner puis d’amplifier en une très grande quantité un fragment d’ADN particulier, présent en très faible quantité au départ, parmi des millions d’autres fragments. Elle se réalise en deux étapes : une amplification de l’ADN par PCR suivie d’une digestion de l’ADN amplifié par une enzyme de restriction. 

 AMPLMCATION PAR PCR (POL YMERASE CHAIN REACTION) 

Avant de lancer la PCR, la première chose à faire est de préparer le milieu réactionnel. Ce milieu comporte 1 ‘ADN à amplifier, les déoxynucléotides ( dNTPs ), les deuxamorces spécifiques (constituées d’oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides et d’orientation inverse, s’hybridant chacune avec un des deux brins), la Taq polymérase (qui a la propriété d’être thennostable à 95°C et d’ avoir un optimum d’activité à 72°C. Ces propriétés pennettent par des cycles de copies successives, la multiplication du nombre de fragments d’ADN), un tampon et des ions magnésium (MgC12). Ces deux derniers composants définissent un milieu avec un pH optimal et une concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de l’enzyme. Le milieu réactionnel ainsi obtenu est placé dans un thermocucleur programmé pour effectuer les différents cycles de la PCR dont chacun est composé d’une succession de paliers de température prédétenninée, et d’ une durée bien définie. Ces deux paramètres, température et temps, dépendant de la taille de la séquence à amplifier de la taille et de la composition en désoxyribonucléotides des amorces, permettent l’ amplification du gène ciblé. L’amplification comprend trois phases: la dénaturation, l’ hybridation et l’élongation. 

Figure 6 : Le schéma montrant les 3 phases d’un cycle d’amplification par PCR (Gauthier, 2009). Figure 7 : Schéma montrant l’augmentation exponentielle de la quantité d’ADN cible à chaque cycle de PCR. La température dans le tube est réglée à 94°C. A ce moment là, l’ADN se dénature. En effet, l’ADN perd sa structure caractéristique en double hélice à cette température. L’ADN doublebrin (2 brins) est dénaturé en ADN simple brin (1 brin). Lors d’hybridation, la température descend jusqu’ à la température dite d’ hybridation. Cette dernière est généralement comprise entre 50°C et 60°C et elle est fonction de la composition en désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) et des amorces. Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On parle alors d’hybridation des amorces au brin d’ADN. Puis la température est amenée à noe, température idéale pour l’activité de la Taq polymérase. C’est une enzyme très spéciale, puisqu’elle est dite thermorésistante. En effet, sa température optimale d’action est de n oe et elle est capable de résister à des températures allant jusqu’ à 100°C. Cette étape permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin complémentaire à l’ADN matrice, grâce aux dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel :l’élongation. Le premier cycle est fini et voilà qu’ un nouveau cycle recommence. Ainsi le gène du cytochrome ba été testé et amplifié par cette technique. 

DIGESTION ENZYMATIQUE 

La technique de digestion enzymatique comme son nom indique utilise des enzymes de restriction. Ces enzymes sont de la classe des endonucléases c’est-à-dire capables d’hydrolyser les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur de la chaîne d’un  acide nucléique. Ces enzymes reconnaissent et coupent au niveau d’un site spécifique de l’ADN (souvent 4 ou 6 paires de bases). La coupure peut avoir lieu, en fonction de l’enzyme, au niveau du site de restriction ou quelques bases en amont ou en aval de ce site. Ainsi, si une mutation ponctuelle survient et modifie un site de restriction initialement présent, l’enzyme ne peut plus le reconnaître et ne coupera pas l’ADN. Par contre, si cette mutation fait apparaître un nouveau site de restriction, l’enzyme fera une coupure supplémentaire. La taille et le nombre des fragments d’ADN obtenus après digestion sont donc dans les deux cas modifiés, et le résultat de la digestion (appelé profil de digestion) est ensuite analysé après migration électrophorétique sur gel d’agarose. Comme la PCR, il existe un protocole pour la digestion. L’enzyme BsmAI (appelé aussi Fast digeste dont les propriétés sont modifiées) provenant de Baci/lus stearothermophi/us est utilisée pour établir les profils de restriction des fragments d’ADN amplifiés. Un Mix de digestion est préparé (Annexe III) et les échantillons, mis à incubation à 37°C dans un thermocycleur pendant 3h. On effectue une migration électrophorétique des produits de digestion à 1 OOV pendant 45 min  sur gel d’ agarose à 2%. Les fragments d’ADN ainsi séparés, sont révélés par le bromure  d’éthidium (BEn sur une table à UV. On obtient alors des profils de restriction que nous pourrons comparer. Les photos sont prises avec un système BioPrint E-BOX l500/26M (Vilber Lourmat).