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Le traitement USP21 altère le développement des embryons et le transcriptome

Les embryons traités par l’extrait USP21 présentent à la fois des défauts de développement, mais aussi des anomalies transcriptomiques. Avec ces données, nous ne pouvons pas définitivement établir un lien de causalité entre dérégulations transcriptionnelles et les défauts de développement. Néanmoins, nous avons mis en évidence plusieurs corrélations entre les analyses morphologiques et transcriptomiques. Par exemple, j’ai mis en évidence que les gènes dérégulés par le traitement USP21 étaient impliqués dans le cycle cellulaire, et pourraient engendrer les défauts de développement de l’embryon. Nous avons aussi observé un parallèle entre l’hétérogénéité du développement des embryons qui meurent à différents stades et l’hétérogénéité des anomalies transcriptomiques avec certains embryons uniques qui avaient un profil transcriptomique similaire à un embryon issu d’un spermatozoïde non traité par USP21. Cette hétérogénéité observée est similaire aux expériences de transfert nucléaire (Hörmanseder et al. 2017) ou d’injection intracytoplasmique de spermatozoïde (Teperek et al. 2016). Dans nos cas, cette hétérogénéité de l’effet de USP21 pourrait provenir de la déubiquitination, partielle de certains spermatozoïdes, ou de l’oeuf qui aurait la capacité de reprogrammer un noyau dont la configuration épigénétique ne serait pas optimale, comme on peut l’observer avec 1% des embryons clonés à partir de cellules d’intestin qui arrivent jusqu’au stade de la grenouille (Pasque et al. 2011). Enfin, l’utilisation d’embryons haploïdes permet de mesurer la transcription de l’embryon dont la chromatine est dérivée uniquement du spermatozoïde, ce qui permet d’identifier un effet du traitement USP21 sur le spermatozoïde sans confusion avec la partie maternelle inactivée au préalable. Néanmoins, une perspective serait de vérifier ce qui se passe dans les embryons diploïdes dans un premier temps, puis d’évaluer indépendamment la contribution maternelle chez Xenopus laevis en déubiquitinant l’ovocyte à l’aide de ChIP anti-H2AK119Ub1. Enfin, j’ai mis en évidence que les gènes dérégulés par le traitement USP21 ont une composante transcriptomique à la fois maternelle et zygotique. Cependant, il est difficile de démontrer si USP21 affecte préférentiellement la composante maternelle et/ou zygotique de ces gènes. L’étude des introns à partir de la vélocité des données RNA-Seq ne nous a pas permis de conclure. Une alternative serait de refaire des expériences RNA-Seq des nouveaux transcrits en marquant les nouveaux transcrits avec le 5-ethynyl uridine (EU) (H. Chen et Good 2022) ou de récupérer le transcriptome des embryons à la ZGA, qui a lieu avant le stade de gastrula où les embryons ont été séquencés dans notre étude. La distribution de H2AK119Ub1 dans le spermatozoïde et au cours du développement embryonnaire Dans la littérature, H2AK119Ub1 est très peu référencé dans le spermatozoïde. Dans les espèces où les histones ne sont pas remodelées comme le zébrafish, il n’y aurait pas de H2AK119Ub1 (Hickey et al. 2022). Dans les espèces avec un grand remodelage des histones comme la souris, H2AK119Ub1 est détectée dans le spermatozoïde, mais n’est pas exploité, car considéré comme non importante notamment suite à l’effacement global (9150/10164 régions) de H2AK119Ub1 du spermatozoïde après fécondation (Z. Chen, Djekidel, et Zhang 2021). Malgré tout, nous avons mis en évidence que dans un contexte de fort remodelage (51437/67233 régions) de H2AK119Ub1 du spermatozoïde après fécondation chez Xenopus laevis, l’information H2AK119Ub1 conservée semblait importante pour le développement de l’embryon. De plus, notre étude montre que H2AK119Ub1 dans le spermatozoïde d’un vertébré a une distribution similaire à celle décrite pour chez les mammifères (Z. Chen, Djekidel, et Zhang 2021). Une limite de notre modèle expérimental est que nous n’avons pas l’information de la contribution maternelle, des expériences de ChIP-Sequencing dans l’ovocyte permettrait de contrôler si on observe une dissymétrie pour H3K4me3 comme chez les mammifères, avec un signal très large sur l’ovocyte, et très localisé sur les spermatozoïdes (Dahl et al. 2016). Enfin, l’utilisation de RECOGNICER est une nouveauté dans cette étude alors que H2AK119Ub1 est très souvent étudié en regardant la région de fixation du complexe PRC1, RING1B (Blackledge et al. 2020) – (Tamburri et al. 2020), ou plus récemment par détection de l’enrichissement du signal avec MACS2 (Hickey et al. 2022). L’utilisation de RECOGNICER dans notre cas permet de caractériser le signal H2AK119Ub1 sur l’épigénome en identifiant des régions similaires qu’avec MACS2 ainsi que de nouvelles régions candidates que MACS2 n’identifie pas. Mon analyse du signal par RECOGNICER met en évidence l’association de la bivalence H2AK119Ub1/H3K4me3 avec les gènes sensibles au traitement USP21. Une perspective d’étude serait d’analyser la proportion de spermatozoïdes qui contiennent cette information épigénétique H2AK119Ub1/H3K4me3. Or, il a été mis en évidence chez Xenopus laevis que seulement une fraction des pics H3K4me3 seraient présents dans tous les spermatozoïdes (Oikawa et al. 2020). Un spike-in de nucléosome H2AK119Ub1 a été ajouté dans certaines expériences en cette perspective, notamment pour déterminer si la marque H2AK119Ub1 était présente sur tous les spermatozoïdes. Une autre perspective serait d’identifier les régions où l’histone H2A est conservée sur tous les spermatozoïdes en employant un modèle de markov caché dit HMM (Oikawa et al. 2020). Ces analyses complémentaires permettraient d’identifier les régions contenant H2AK119Ub1 dans tous les spermatozoïdes, dans un cas où H2A est forcément retenue. Enfin, il est possible que d’autres marques d’histones non investiguées pourraient jouer un rôle de relai de l’information épigénétique dans l‘embryon après la fécondation ou que l’effet de l’effacement de H2AK119Ub1 se manifeste uniquement dans des conditions spécifiques comme par la présence des facteurs de transcription des gènes régulés par H2AK119Ub1.
L’effet sur le développement de l’embryon par USP21 est-il spécifique de son activité deubiquitylase ?
Notre approche de traitement par USP21 élimine les effets indirects qui peuvent se produire lorsqu’on altère l’épigénome pendant la spermatogénèse ou durant l’embryogenèse précoce, puisque nous altérons uniquement l’épigénome du spermatozoïde. Cependant, nous n’avons pas de preuve formelle que l’effet de USP21 est lié à son activité d’effacement de H2AK119Ub1 comme décrit précédemment. L’effet observé pourrait être lié à une autre activité, ou la déubiquitination d’une autre protéine par USP21. Néanmoins, plusieurs arguments suggèrent un effet dépendant de l’activité d’effacement de H2AK119Ub1 par USP21. Premièrement, on observe que ~75% des gènes sont up-régulés lors du traitement par USP21, ce qui est compatible avec l’élimination de la marque répressive H2AK119Ub1. On observe aussi une association des régions régulatrices des gènes affectés par le traitement USP21 avec la présence de H2AK119Ub1. Enfin, nous avons identifié que les gènes dérégulés par USP21 sont enrichis en H2AK119Ub1 lorsqu’ils sont également marqués avec H3K4me3 et qu’ils maintiennent H2AK119Ub1 après réplication dans l’embryon. L’effet de USP21 pourrait ainsi se manifester que lorsque H2AK119Ub1

Table des matières

REMERCIEMENTS
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
L’EPIGENETIQUE : DE L’HEREDITE A LA VARIABILITE INDIVIDUELLE
Les fondations du concept de la régulation épigénétique
Les différents supports de l’épigénétique
Le nucléosome, une organisation spécifique de la chromatine pour la régulation génique
DU SPERMATOZOÏDE A L’EMBRYON : TRANSMISSION DE L’INFORMATION GENETIQUE ET EPIGENETIQUE
Xenopus laevis, un modèle biologique pertinent
De la spermatogénèse au développement embryonnaire précoce
La spermatogenèse, un processus de maturation des spermatozoïdes
Le développement embryonnaire chez Xenopus laevis
La contribution épigénétique du spermatozoïde au développement embryonnaire
H2AK119Ub1 a un rôle central dans l’établissement du complexe polycomb dans les cellules souches embryonnaires
CHAPITRE I- LE PRETRAITEMENT DU SPERMATOZOÏDE PAR LA DEUBIQUITYLASE USP21 ALTERE LE DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE
CHAPITRE II – LE TRAITEMENT DES SPERMATOZOÏDES PAR LA DEUBIQUITYLASE USP21 ENTRAINE DES DEREGULATIONS
L’EXPRESSION DES GENES DANS LA GASTRULA
OUTILS UTILISES POUR L’ANALYSE DU TRANSCRIPTOME PAR RNA-SEQUENCING
Du séquenceur à la matrice d’expression des gènes : formatage des données
Fastq, le fichier brut issu du séquenceur
BAM, l’alignement des reads sur un génome
Du BAM à la matrice de comptage
De la matrice d’expression des gènes à l’identification des gènes différentiellement exprimés
Pré-traitement des données
Filtration
La gestion des échantillons aberrants
La normalisation
L’effet batch
L’analyse de gènes différentiellement exprimés
L’enrichissement fonctionnel
LE PRE-TRAITEMENT DU SPERMATOZOÏDE PAR USP21 AVANT L’INJECTION DANS L’OEUF ALTERE LE TRANSCRIPTOME DE L’EMBRYON
DEFAUT D’ELIMINATION DES ARNS MATERNELS OU INDUCTION DE LA TRANSCRIPTION ZYGOTIQUE DES GENES SENSIBLES AU TRAITEMENT USP21
CHAPITRE III- CARACTERISATION DE LA DISTRIBUTION DE H2AK119UB1 DANS LE SPERMATOZOÏDE
ANALYSE DE L’EPIGENOME PAR CHIP-SEQUENCING
DETAILS DES ETAPES ET OUTILS UTILISES DANS LES ANALYSES CHIP-SEQ
Élimination des séquences adaptatrices et des reads de faible qualité
Alignement des reads sur un génome de référence
Identification des régions du génome présentant un enrichissement pour une modification d’histone
Visualisation du signal sur le génome
La gestion des réplicats
H2AK119UB1 EST ENRICHIE SUR LES GENES SENSIBLES AU TRAITEMENT USP21
H2AK119Ub1 est associé aux régions régulatrices du génome dans le spermatozoïde
Les gènes dérégulés par le traitement USP21 montrent un enrichissement pour H2AK119Ub1 dans le spermatozoïde70
LES COMBINAISONS DE MARQUES EPIGENETIQUES ASSOCIEES A H2AK119UB1 DANS LA CHROMATINE DU SPERMATOZOÏDE
Distribution de H3K4me3 et/ou H3K27me3 dans les régions du génome du spermatozoïde enrichies pour H2AK119Ub1
H2AK119Ub1 associé avec H3K4me3 est enrichi sur les gènes sensibles au traitement USP21
CHAPITRE IV – APRES REPLICATION DE LA CHROMATINE DU SPERMATOZOÏDE, UNE CONFIGURATION BIVALENTE H2AK119UB1/H3K4ME3 EST MAINTENUE SUR LES GENES SENSIBLES AU TRAITEMENT USP21
REPLICATION DE LA CHROMATINE DU SPERMATOZOÏDE PAR INCUBATION DANS UN EXTRAIT D’OEUF
LE DEVENIR DE H2AK119UB1 ET H3K4ME3 APRES LA PREMIERE REPLICATION
La réplication de la chromatine du spermatozoïde est associée à un remodelage extensif de la distribution de H2AK119Ub1 et à une stabilité de celle de H3K4me3
H2AK119Ub1 après réplication est préférentiellement associé avec les gènes sensibles au traitement USP21
DANS UN CONTEXTE GLOBAL DE DILUTION REPLICATIVE DE H2AK119UB1, LES GENES SENSIBLES AU TRAITEMENT USP21 MAINTIENNENT UN NIVEAU PRE-REPLICATIF DE CETTE MARQUE
Pipeline spikChIP appliqué aux échantillons Xenopus laevis couplés à la drosophile
DISCUSSION
H2AK119UB1 DU SPERMATOZOÏDE A L’EMBRYON
LE TRAITEMENT USP21 ALTERE LE DEVELOPPEMENT DES EMBRYONS ET LE TRANSCRIPTOME
LA DISTRIBUTION DE H2AK119UB1 DANS LE SPERMATOZOÏDE ET AU COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE
L’EFFET SUR LE DEVELOPPEMENT DE L’EMBRYON PAR USP21 EST-IL SPECIFIQUE DE SON ACTIVITE DEUBIQUITYLASE ?
LA TRANSMISSION DE H2AK119UB1 DU SPERMATOZOÏDE A L’EMBRYON
H2AK119UB1 DANS UN CONTEXTE DE TRANSMISSION INTERGENERATIONNELLE
PUBLICATION ET EVEIL SCIENTIFIQUE
REFERENCES
ABREVIATIONS
ARTICLE

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