Contribution au développement d’un microsystème pour la séparation bidimensionnelle de protéines par électrophorèse
Généralités sur l’allergie
Définition
Le terme allergie, des mots grec allos signifiant autre et ergon action, a été défini par Von Piquet en 1906 comme « une altération de la capacité de l’organisme de réagir à une substance étrangère ». L’allergie, ou réaction d’hypersensibilité de type I (immédiate), est une exacerbation de la réponse immunitaire visàvis de substances inoffensives communes que l’on appelle allergènes. Elle intervient chez des individus prédisposés génétiquement à produire ce genre de réponse dans des conditions d’exposition particulières. Ces conditions mettent en jeu l’allergène luimême, sa structure, sa dose, son mode d’entrée, sa voie d’entrée, sa fréquence d’administration, son moment d’entrée, et l’individu par son statut immunologique au moment de la sensibilisation.
Mécanismes
Après une première phase de rencontre avec l’allergène, appelée sensibilisation, une réponse immunitaire préférentielle de type Th2 s’engage (Figure 1). La réponse immunitaire Th2 est caractérisée par la production de certaines cytokines polarisant la réponse immune et conduisant, entre autres, à la production d’immunoglobulines d’isotype IgE, spécifiques de l’allergène. Les IgE peuvent ensuite se fixer sur leurs récepteurs de haute affinité (RFcεI) exprimés par différentes cellules spécialisées de la lignée hématopoiétique contenant de nombreux granules intracytoplasmiques. Ces dernières peuvent être des basophiles, cellules circulantes, ou bien des mastocytes, leurs homologues tissulaires. Les allergènes, lors de leurs réintroductions, se fixent sur les IgE spécifiques liées à leur récepteur membranaire. Ceci induit une cascade de signalisation aboutissant à la dégranulation c’estàdire la libération des médiateurs immunitaires et de l’inflammation (telle que l’histamine) contenus dans les granules des cellules. Ces médiateurs (amines biogènes et cytokines) ont des effets immédiats, vasodilatateurs et/ou bronchoconstricteurs, et retardés de type inflammatoire (recrutement de cellules sur les lieux de l’inflammation). Ils sont à l’origine des symptômes observés: asthme, Chapitre 1 : Etude bibliographique 7 rhinoconjonctivite, kératite, prurit, eczéma, ou de son expression la plus aiguë: l’anaphylaxie. Figure 1: représentation schématique du mécanisme de l’allergie, hypersensibilité de type I (immédiate).
Importance des allergies alimentaires
Cas de l’allergie au lait Depuis 20 ans, les allergies alimentaires sont de plus en plus fréquentes et de plus en plus complexes . Bien que leur prévalence soit surestimée par le grand public car elles sont confondues avec des hypersensibilités ne faisant pas intervenir de mécanisme immunologique, elles concernent tout de même environ 5% des enfants et 3% des adultes. Il existe cependant des disparités importantes en fonction des pays, de l’âge et des habitudes de consommation. Les allergènes alimentaires les plus fréquents chez l’enfant et l’adulte sont présentés en Tableau 1. Audelà de trois ans, l’arachide est le premier allergène. Il est d’autant plus important qu’il est le premier responsable des anaphylaxies sévères déclarées par le réseau d’allergovigilance en France et en Belgique (11,5% en 2007).Tableau 1 : Allergènes alimentaires les plus fréquents chez l’enfant et l’adulte (données du Centre d’Investigations Cliniques et Biologiques en Allergologie Alimentaire). Adapté de [1]. Chez l’enfant, le lait de vache est le deuxième aliment responsable d’allergies derrière l’œuf, mais son importance est primordiale car il reste le premier aliment des nourrissons. L’allergie au lait de vache débute souvent avant l’âge de six mois mais disparaît généralement au cours de l’enfance après éviction du lait du régime alimentaire. Les protéines du lait de vache peuvent être séparées en deux fractions par acidification : le lactosérum et le lait caillé ou coagulé. La composition en protéines de ces deux fractions, leurs points isoélectriques et leurs masses moléculaires, ainsi que le taux de patients qui y sont sensibilisés sont présenté en Tableau 2. Protéines % des protéines du lait total Point isoélectrique Masse moléculaire (kDa) % des patients sensibilisés Caséine αs1 32 5 23,6 Caséine αs2 10 5,3 25,2 Caséine β 28 5,2 24 Lait caillé Caséine κ 10 5,5 19 66 βlactoglobuline A 5,25 18 βlactoglobuline B 10 5,35 18 58 αlactalbumine 5 4,24,5 14,4 38 Immunoglobulines 1 5,56,8 1501000 n.d. BSA (albumine) 3 4,74,9 66 50 Lactosérum Lactoferrine traces 8,3 78 45 Tableau 2 : Composition des différentes fractions du lait en protéines et taux de patient y étant sensibilisés. Adapté de [2] Chapitre 1 : Etude bibliographique 9 La plupart des protéines du lait font réagir plus de la moitié des patients : ce sont des allergènes dit majeurs. En outre, de nombreux patients sont sensibilisés à plusieurs de ces protéines. Comme nous l’avons vu en introduction générale, la détermination des protéines auxquelles un patient est allergique se fait par test ELISA [3, 4] ou par séparation bidimensionnelle en gel de l’extrait allergénique [5]. Ces techniques sont relativement longues et laborieuses, c’est pourquoi nous nous proposons d’essayer de réaliser la séparation des composants d’un extrait allergénique en microsystème bidimensionnel, en mettant en œuvre deux mécanismes de séparation électrophorétiques : la focalisation isoélectrique et l’électrophorèse de zone en électrolytes peu conducteurs. Notre approche consistant à mettre au point des séparations électrophorétiques au format capillaire avant de les transposer en microsystèmes, nous allons donc tout d’abord nous intéresser aux séparations en électrophorèse capillaire.
Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.
1.1. GENERALITES SUR L’ALLERGIE
1.1.1. Définition
1.1.2. Mécanismes
1.1.3. Importance des allergies alimentaires. Cas de l’allergie au lait
1.2. ELECTROPHORESE CAPILLAIRE : GENERALITES
1.2.1. Phénomènes de migration
1.2.1.1 Migration électroosmotique
1.2.1.2. Migration électrophorétique
1.2.2. Principaux modes de séparation électrocinétique
1.2.2.1. Electrophorèse de zone (ECZ)
1.2.2.2. Focalisation isoélectrique capillaire (CIEF)
1.2.2.3. Electrophorèse capillaire en gel (ECG)
1.2.2.4. Chromatographie électrocinétique micellaire capillaire (CEMC).
1.2.2.5. Electrochromatographie capillaire (ECC)
1.2.2.6. Isotachophorèse (ITP)
1.2.3. Limitations en électrophorèse capillaire
1.2.3.1. Effet Joule
1.2.3.2. Adsorption des analytes
1.3. FOCALISATION ISOELECTRIQUE CAPILLAIRE (CIEF)
1.3.1. Principe
1.3.1.1. Focalisation
1.3.1.2. Mobilisation
1.3.1.3. Détection
1.3.2. Evaluation des performances d’une séparation en CIEF
1.3.3. Voies de synthèse et structure des ampholytes porteurs
1.3.4 Facteurs influençant la formation du gradient de pH
1.3.4.1. Phénomène de plateau
1.3.4.2. Dérive cathodique
1.3.4.3. Influence de l’écoulement électroosmotique
1.3.4.4. Compression du gradient de pH
1.3.4.5. Modification du gradient de pH
1.3.5. Autres types de gradients de pH
1.4. ELECTROPHORESE CAPILLAIRE DE ZONE EN SOLUTIONS QUASIISOELECTRIQUES D’AMPHOLYTES (CABCE)
1.4.1 Utilisation de solutions peu conductrices en ECZ
1.4.2. La courbe d’électrotitrage (CET). Fractionnement des ampholytes porteurs.
1.4.3 Electrophorèse de zone en solutions quasiisoélectriques d’ampholytes (CABCE)
1.5. MICROSYSTEMES POUR LA SEPARATION DE PROTEINES
Sommaire
1.5.1. Matériaux utilisés pour la fabrication de microsystèmes analytiques et traitements de surface
1.5.2. Dérivation de protéines pour la détection de fluorescence
1.5.3. Séparations monodimensionnelles de protéines
1.5.3.1. Electrophorèse en gel
1.5.3.2. Electrophorèse de zone
1.5.3.3. Focalisation isoélectrique
1.5.4. Séparations bidimensionnelles
1.6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 2 : SEPARATION DE PROTEINES PAR FOCALISATION
ISOELECTRIQUE CAPILLAIRE ET UTILISATION DE COUPES
ETROITES D’AMPHOLYTES PORTEURS POUR AMELIORER LA
RESOLUTION
2.1. INTRODUCTION
2.2. ARTICLE 1: COMPARISON OF DIFFERENT CAPILLARY ISOELECTRIC FOCUSING METHODS –USE OF “NARROW PH CUTS”OF CARRIER AMPHOLYTES AS ORIGINAL TOOLS TO IMPROVE RESOLUTION
2.3. ARTICLE 2: USE OF QUASIISOELECTRIC BUFFERS AS ANOLYTE AND CATHOLYTE TO IMPROVE CIEF
PERFORMANCES
2.4. UTILISATION DE NC COMME ANOLYTE ET CATHOLYTE : EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES
2.4.1. Variation de la nature des NC utilisés comme catholyte
2.4.2. Utilisation d’anolytes et de catholytes de différentes natures en présence d’un capillaire greffé
2.5. CONCLUSION
2.6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE 3 : SEPARATION DE PROTEINES DU LAIT PAR
FOCALISATION ISOELECTRIQUE EN MICROSYSTEMES
3.1. INTRODUCTION ET EXPÉRIENCES PRÉLIMINAIRES
3.2. ARTICLE 3:VERSATILE METHOD FOR EOF MEASUREMENTS IN MICROCHIP CE
3.3. ARTICLE 4: EVALUATION OF MICROCHIP MATERIAL AND SURFACE TREATMENT OPTIONS FOR ISOELECTRIC
FOCUSING OF ALLERGENIC MILK PROTEINS ON MICROCHIPS.
3.4. CONCLUSION
3.5. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Sommaire
viii
CHAPITRE 4 : SEPARATION DE PROTEINES PAR
ELECTROPHORESE DE ZONE EN SOLUTIONS QUASIISOELECTRIQUES D’AMPHOLYTES, AU FORMAT CAPILLAIRE ET
EN MICROSYSTEMES…………………143
4.1. INTRODUCTION 144
4.2. FRACTIONNEMENT DES AMPHOLYTES ET CARACTERISATION DES FRACTIONS OBTENUES 146
4.2.1. Fractionnement d’un mélange d’ampholyte de gamme large de pH 147
4.2.1.1. pH des fractions obtenues. 148
4.2.1.2. Conductivités des fractions obtenues 149
4.2.1.3. Séparation d’un mélange test de protéines. 150
4.2.2. Fractionnement de mélanges d’ampholytes de gammes de pH étroites 151
4.2.2.1. pH des fractions obtenues. 152
4.2.2.2. Conductivité des fractions obtenues 153
4.2.2.3. Mesure des FEO en électrolytes constitués de coupes étroites d’ampholytes 155
4.3. UTILISATION D’ELECTROLYTES QUASIISOELECTRIQUES POUR LA LIMITATION DE L’ADSORPTION DES
PROTEINES EN ECZ. 157
4.3.1. Article 5: Use of quasiisoelectric buffers to limit protein adsorption in CZE……… 157
4.3.2. Perspectives…………………………………………………………………………. 165
4.4. DERIVATION COVALENTE DE PROTEINES POUR LA DETECTION PAR FLUORESCENCE . 166
4.4.1. Stabilité du FITC 166
4.4.2. Optimisation des conditions de dérivation 168
4.4.3. Dérivation d’autres protéines 173
4.5. SEPARATION EN ELECTROPHORESE DE ZONE EN MICROSYSTEMES 174
4.5.1. Séparation de composés modèles 175
4.5.2 Séparation de protéines du lait . 178
4.5.3. Conclusions. 184
4.6. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 185
CHAPITRE 5: PERSPECTIVES…………………………… 187
5.1. INTRODUCTION 188
5.2. UTILISATION DE TENSIOACTIFS POUR AMELIORER LES SEPARATIONS EN ELECTROPHORESE CAPILLAIRE
ET EN MICROSYSTEMES 190
5.2.1. Utilisation de tensioactifs pour améliorer la sensibilité. 190
5.2.1.1. Influence de la présence de CHAPS sur la détection de la BSA 191
5.2.1.2. Influence de la présence de CHAPS sur la détection de l’αlactalbumine et de la βlactoglobuline A. 193
5.2.2. Utilisation de tensioactifs pour améliorer la résolution. Application à la séparation des
protéines du lait écrémé 197
5.3. COUPLAGE DES DEUX DIMENSIONS DE SEPARATION 201
Sommaire
ix
5.4. CONCLUSIONS 207
5.5. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 208
ANNEXES………………………………………………………213
ANNEXE 1 : FRACTIONNEMENT D’AMPHOLYTES AVEC LE ROTOFOR® : CONDITIONS EXPERIMENTALES 214
ANNEXE 2 : ELECTROLYTES UTILISES POUR LES MESURES DE FLUX ELECTROOSMOTIQUES. 215
ANNEXE 3 : REACTION DE DERIVATION AU FITC 216
ANNEXE 4 : COMPOSES MODELES UTILISES EN MICROSYSTEMES 218
ANNEXE 5 : MONTAGE MICROFLUIDIQUE 219
ANNEXE 6 : INJECTION EN ELECTROPHORESE DE ZONE EN MICROSYSTEMES 221
ANNEXE 7 : CALCUL DU CHAMP ELECTRIQUE APPLIQUE DANS UN MICROSYSTEME LORS D’UNE SEPARATION EN
ELECTROPHORESE DE ZONE. 222
ANNEXE 8 : POTENTIELS APPLIQUES LORS DES SEPARATIONS EN ELECTROPHORESE DE ZONE EN
MICROSYSTEME 224
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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