Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et
Candida issus des patients VIH positifs

  Le complexe Candida albicans

albicans a pendant longtemps été la seule espèce de Candida capable de produire un tube germinatif dans du sérum et cette caractéristique était utilisée pour l’identification de l’espèce. Cependant, Jones et Martins ont identifié des souches atypiques de C. albicans qui n’assimilent pas le sucrose et produisent faiblement des chlamydospores. Ces souches ont par la suite été identifiées et nommées C. stallatoidea. Grace à la technique d’électrocaryotypage, KwonChung et al. (88) ont montré que C. stellatoidea peut être subdivisée en 2 espèces différentes, C. stellatoidea type I considérée comme une espèce isolée, et C. stellatoidea type II considérée comme un mutant sucrose négatif de C. albicans. Ensuite, Sullivan et al. (95) ont identifié une autre souche atypique de C. albicans qui n’assimile pas le α-méthyl-D-glucoside, le lactate et le xylose, bien qu’étant blastèse et chlamydospore positive. Elle a été nommée C. dubliniensis. Tietz et al. (2) ont enfin identifié C. africana qui donne un test de blastèse positif et est cependant incapable de produire des chlamydospores et n’assimile pas la Nacétylglucosamine et la glucosamine. Ces espèces qui sont capables de produire un tube germinatif dans du sérum sont aujourd’hui regroupées sous le terme d’espèces du complexe C. albicans et on y retrouve : C. albicans, C. stellatoidea type I, C. dubliniensis et C. africana. Les méthodes phénotypiques et biochimiques conventionnelles ne sont pas capables de les identifier formellement. Toutefois, l’évolution dans les techniques de biologie moléculaire a permis à Romeo et Criseo (8) de mettre sur pied une technique qui permet de séparer ces 4 espèces sans ambiguïté. L’amplification du gène Hwp1 commun à ces 4 espèces avec une paire d’amorces spécifiques (CR-f 5ʹ-GCTACCACTTCAGAATCATCATC-3ʹ/CR-r 5ʹ GCACCTTCAGTCGTAGAGACG-3ʹ) donne des profils différents pour chacune de ces espèces tel que représenté dans le tableau 3. Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 28 Tableau 3: Tailles des fragments amplifiés du gène Hwp1 pour chaque espèce du complexe Candida albicans (Romeo et Criseo, 9). Espèce Taille de la bande obtenue (pb) C. albicans 941pb C. dubiniensis 569pb C. stellatoidea type I 8pb C. africana 7pb  Candida albicans Candida albicans, levure opportuniste, est le pathogène fongique le plus commun chez l’homme. Elle est responsable entre autres, de diverses candidoses orales et de vaginites, deux infections très répandues (Segal, 5). C. albicans fait partie de la microflore indigène vaginale et oro-gastro-intestinale de l’être humain et de nombreuses espèces animales. Elle est détectée chez au moins 7% de la population humaine saine (Ruhnke & Maschmeyer, 2). Normalement, un équilibre existe entre l’hôte et la microflore endogène, favorisant l’état commensal de C. albicans. Par contre, certains facteurs contribuent à dévoiler son caractère pathogène opportuniste, notamment dans des conditions d’affaiblissement du système immunitaire ou de modification de la flore bactérienne (Perlroth et al., 7). C. albicans, levure d’abord considérée asexuée, fut classée dans le phylum des deutéromycètes (Fungi imperfecti), ensuite, la découverte du cycle sexué potentiel a permis de la classer dans la division des ascomycètes (Nebavi et al., 6 ; Hull et al., ; Magee and Magee, ). La classification actuelle de C. albicans est la suivante : Empire : Eucaryote (Eukaryota) Rang/Règne : Champignon (Fungi) Embranchement/Division/Phylum : Ascomycètes (Ascomycota) Sous-embranchement/Sous-division/Sous-phylum : Saccharomycotina Classe : Saccharomycetes Ordre : Saccharomycetales Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 29 Famille : Saccharomycetaceae Genre : Candida Espèce : albicans (Jones et al., 4) Ø Croissance de C. albicans C. albicans croît sur des milieux de culture définis, riches ou pauvres, contenant des sources de sel, de carbone, d’azote et de phosphate, et nécessite la présence de biotine. La levure se développe dans des conditions de pH variant entre 2 et 8 et dans un intervalle de température de à 45°C, sa température optimale de croissance étant de 37°C. Son temps de génération maximal est de ,3 à ,4.heures-1, dans un milieu de culture synthétique, elle est anaérobie facultative (Bahn and Muhlschlegel, 6 ; Dumitru et al., 4). Ø Formes morphologiques de C. albicans Une caractéristique importante de cette levure est sa capacité à croître sous plusieurs formes morphologiques : levure (blastospore), hyphe, pseudohyphe, projection sexuelle (shmoo), chlamydospore et bourgeon hyperpolarisé (Whiteway and Bachewich, 7) (Figure 6). Cette diversité morphologique est considérée comme étant une stratégie de survie, permettant sa croissance et sa dissémination dans l’hôte (Berman and Sudbery, 2). Les blastospores, les hyphes et les pseudohyphes sont les formes les plus fréquemment rencontrées. Elles coexistent souvent dans les cultures végétatives et dans les sites infectés (Sudbery et al., 4). Pourtant, des conditions de culture permettant le développement de C. albicans majoritairement sous une seule forme morphologique ont été définies en laboratoire. Il est à noter que ce pathogène est capable de passer, et de manière réversible entre la forme blastospore, hyphe et pseudohyphe (Whiteway and Bachewich, 7). Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 3 Figure 6 : Différentes présentations morphologiques de Candida albicans (Whiteway and Bachewich, 7). Ø Les blastospores sont des cellules ovoïdes d’environ 3 à 5μm qui se reproduisent par bourgeonnement asexué multipolaire (asymétrique). La cellule mère produit un bourgeon (blastoconidie), qui va se séparer après formation d’une cloison (anneau de septine) et donner naissance à une cellule fille. Les cellules se séparent après la cytokinèse, lorsque la cellule fille n’a pas encore atteint la taille de la cellule mère. Le noyau se divise dans la jonction formée entre la cellule mère et le bourgeon (Whiteway and Bachewich, 7 ; Berman, 6). Ø Les hyphes sont des tubes microscopiques, longs et minces (environ 2μm de diamètre), qui contiennent plusieurs unités cellulaires, divisées par des septa (Figure 6). Les hyphes possèdent des parois parallèles, sans constriction visible au site de séparation. Elles naissent d’une blastospore ou d’un hyphe déjà existant. Leur formation est initiée par le développement des tubes de germination et des invaginations cylindriques précédant l’apparition du premier septum. Les hyphes contiennent aux moins trois fois plus de chitine que les blastospores (Chaffin et al., 98). Les hyphes peuvent donner naissance Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 31 soit aux blastospores qui vont bourgeonner latéralement, soit aux nouvelles branches hyphales. Ø Les pseudohyphes étaient vues auparavant comme une forme intermédiaire entre les blastospores et les hyphes, mais certaines études les considèrent comme une forme totalement distincte (Sudbery et al., 4). Les pseudohyphes ressemblent aux blastospores au niveau du cycle cellulaire, les seules différences étant la forme cellulaire plus allongée (≥2,8μm de diamètre), le bourgeonnement unipolaire et l’attachement des cellules après la cytokinèse (Figure 6). Ceci conduit à la formation des chaînes embranchées, constituées des bourgeons allongés. Cette structure facilite la recherche de nutriments loin de la cellule parentale (Whiteway and Bachewich, 7 ; Berman, 6). Les pseudohyphes bourgeonnent à partir d’une blastospore ou d’un hyphe. Les bourgeons peuvent être tellement allongés qu’ils ressemblent morphologiquement aux hyphes, mais ils se distinguent de ceux-ci par la présence des constrictions à l’endroit du septum entre les bourgeons. À cause de cette forte ressemblance, les pseudohyphes et les hyphes sont souvent retrouvées sous le nom des formes filamenteuses de C. albicans (Sudbery et al., 4). Ø Les projections sexuelles (shmoos) sont des élongations des cellules en phase opaque, en réponse aux phéromones sexuelles (Figure 6). Les cellules opaques sont des cellules allongées, avec une paroi cellulaire ondulée, qui forment des colonies de phénotype opaque. Les shmoos sont des formes caractéristiques des cellules compétentes pour le cycle sexuel (mating-competent cells). Ils ont été observés uniquement dans des mélanges cellulaires contenant les deux types sexuels opposés (a/a et α/α) (Whiteway and Bachewich, 7). Ø Les chlamydospores sont de grosses cellules sphériques de 8 à μm, avec une paroi cellulaire épaisse (Figure 6). Elles apparaissent in vitro dans des conditions de culture défavorables, de longue durée, et sont observées très rarement in vivo (Cole et al., 91 ; Chabasse et al., 88). Les chlamydospores se forment par bourgeonnement sur des hyphes ou des pseudohyphes, à l’extrémité des cellules ampulliformes (suspensor cells–structures allongées sous forme d’amphore qui sont un embranchement des formes filamenteuses) (Staib and Morschhauser, 7; Whiteway and Bachewich, 7 ; Martin et al., 5). Les chlamydospores sont produites uniquement par C. albicans et C. dubliniensis (Staib and Morschhauser, 7). Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 32 Ø Les bourgeons hyperpolarisés sont des structures similaires aux hyphes, les seules différences étant la présence d’une constriction entre la blastospore et le bourgeon allongé et l’absence de la réplication de l’ADN dans le bourgeon germé (Figure 6). De ce fait, les bourgeons hyperpolarisés meurent éventuellement car ils sont incapables de continuer le cycle cellulaire (Whiteway and Bachewich, 7). Ø Morphologie des colonies et commutation phénotypique On peut rencontrer en culture, pour C. albicans des colonies lisses, chevelues, plissées, étoilées, en anneau, pointillées, crêpelées, en chapeau, etc. Quelques exemples sont montrés dans la Figure 7. Trois cent quatre-vingt-quatre morphologies différentes ont été décrites (Rustchenko-Bulgac et al., 9), et seulement 5 à 8 phénotypes sont le plus souvent rencontrés (Radford et al., 94). Figure 7 : Exemples de phénotypes de colonies de C. albicans. Une seule souche peut présenter plusieurs types de colonies selon différents milieux ou suite à la commutation phénotypique. a – Colonies lisses sur milieu SDC (Salt-Dextrose Complete); b – Colonie plissée sur milieu Spider; c – Colonie chevelue sur milieu lait-Tween; d – Colonie incorporée dans une matrice de milieu riche en sucrose; e – Commutation phénotypique white-opaque sur milieu SDC, W – colonies en phase blanche, O – colonies en phase opaque; f, g – Les colonies plissées, chevelues et incorporées sont formées d’un mélange des blastospores, pseudohyphes et hyphes. Les photos montrent des populations cellulaires dérivant des différentes portions d’une colonie plissée (Berman & Sudbery, 2). C’est le nombre et la proportion de blastospores, d’hyphes et de pseudohyphes qui déterminent le phénotype d’une colonie (Figure 7f et 7g). Une colonie formée uniquement des blastospores a un aspect lisse, tandis que la présence des formes filamenteuses lui donne une Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 33 apparence plus ou moins chevelue (Vargas et al., 4 ; Berman and Sudbery, 2 ; Radford et al., 94). La morphologie des colonies semble jouer un rôle important dans l’adaptabilité et la survie de C. albicans dans différentes conditions environnementales. Le fait que C. albicans soit capable de réaliser une transition morphologique de la forme levure aux formes filamenteuses conduit à une autre caractéristique importante de ce pathogène : la commutation phénotypique (phenotypic switching). Le système de commutation phénotypique le mieux étudié chez C. albicans est le système white-opaque. Dans ce système, la levure peut générer deux phénotypes de colonies : le phénotype white (colonies standards, blanches et lisses) et le phénotype opaque (colonies larges, grises et aplaties) (Figure 7e). Les colonies de phénotype white sont formées des levures sous forme blastospore tandis que les cellules en phase opaque ont une forme allongée d’haricot et sont trois fois plus grandes que les cellules en phase blanche (Slutsky et al., 87). La commutation white-opaque est intimement liée au cycle sexuel de C. albicans. Seules les cellules homozygotes pour le locus des gènes MTL (Mating Type-Like) du cycle sexuel sont capables de changer de phénotypes (Miller & Johnson, 2). La majorité des cellules de C. albicans (97% des souches) est hétérozygote pour ce locus (MTLa/MTLα) et ces cellules sont donc incapables de modifier leur phénotype (Lockhart et al., 2). 

 Candida dubliniensis 

e C. dubliniensis est une espèce appartenant au genre Candida, identifiée en 95 par une équipe irlandaise de Dublin (Sullivan et al., 95) d’où son nom. En effet, Sullivan et al. ont remarqué la présence d’isolats de Candida atypiques isolés dans la bouche de 6 patients VIH positifs et 3 patients VIH négatifs (deux héroïnomanes et un sujet immunocompétent). Ces isolats avaient un test de filamentation positif et un test de chlamydosporulation positif avec des chlamydospores abondantes arrangées en triplets ou en paires contiguës et avaient un profil atypique d’assimilation des sucres. L’étude génomique par la méthode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) et l’analyse caryotypique a montré que ces isolats avaient un génome significativement différent de celui des autres espèces de Candida mais proche de celui de C. albicans. Ainsi, l’ensemble des caractéristiques génotypiques, phénotypiques et Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 34 biologiques a abouti à l’individualisation de cette nouvelle espèce, Candida dubliniensis (Sullivan et al., 95). Ø Épidémiologie Les isolats de C. dubliniensis sont majoritairement isolés dans la cavité orale des sujets infectés par le VIH, en particulier ceux qui souffrent d’épisodes récurrents de candidose oro-pharyngée. Cette espèce a été isolée au niveau d’autres sites anatomiques tels que le vagin, les urines, les poumons et le sang, non seulement chez des sujets VIH positifs mais aussi chez des sujets VIH négatifs aussi bien immunodéprimés (cancéreux, transplantés…) qu’immunocompétents (Anane et Khalfallah, 6 ; Fotedar et Al Hedaithy, 3 ; Sullivan and Coleman, 98). Depuis le premier cas découvert à Dublin, C. dubliniensis a été isolé et identifié dans de très nombreuses régions du monde : Irlande, Argentine, Australie, Belgique, Canada, France, Finlande, Grèce, États-Unis, Venezuala, Allemagne, Espagne, Kuwait, Arabie Saoudite et Israël (Brito et al., 6a ; Ellepola et al., 3 ; Fotedar et Al Hedaithy, 3 ; Sullivan and Coleman, 98). Ø Méthodes d’identification de Candida dubliniensis Cette espèce partage plusieurs caractères phénotypiques avec C. albicans incluant la production des colonies blanches crémeuses sur Sabouraud, la capacité de formation des tubes germinatifs sur sérum et la formation des chlamydospores terminales sur des milieux pauvres (riz agar tween, pomme de terre-carotte-bile). Ces similitudes phénotypiques causent des problèmes significatifs pour l’identification de C. dubliniensis par les méthodes de routine (Anane et al., 7 ; Fotedar et Al Hedaithy, 3 ; Sullivan et Coleman, 98). Diverses méthodes phénotypiques (tableau 4), immunologiques et moléculaires appropriées à l’identification de Candida dubliniensis ont été évaluées. Sur le milieu CHROMagar les colonies de C. albicans apparaissent vertes claires alors que celles de Candida dubliniensis sont vertes foncées. Cependant, ce critère n’est pas exhaustif car seulement 56,6 % à 94 % des isolats de Candida dubliniensis présentent une couleur verte foncée en primoculture. Ce caractère peut être absent au cours de repiquage ou de conservation (Borst et al., 3 ; Ellepola et al., 3 ; Fotedar et Al Hedaithy, 3). Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 35 Tableau 4 : Méthodes phénotypiques de distinction entre Candida dubliniensis et Candida albicans (Anane et al., 7). Caractère phénotypique Candida albicans Candida dubliniensis Couleur des colonies sur CHROMagar Vert clair Vert foncé Couleur des colonies sur Candida ID 2 Bleu cobalt Bleu turquoise Croissance à 45 °C Positive Négative Production des chlamydospores sur Casein agar Absence de chlamydospores Chlamydospores abondantes Aspect des colonies et production des chlamydospores sur Staib agar Colonies lisses, Absence des chlamydospores Colonies rugueuses, Chlamydospores abondantes Aspect des colonies et production des chlamydospores sur Sunflower agar Colonies lisses, Absence des chlamydospores Colonies rugueuses, Chlamydospores abondantes Production des chlamydospores sur Tomato Juice agar Absence des chlamydospores Chlamydospores abondantes Croissance sur Sabouraud hypertonique Positive Négative Assimilation de D-xylose Positive Négative Assimilation de α-méthyl-D-glucoside Positive Négative Dans la majorité des tests d’assimilation effectués, C. dubliniensis n’assimile pas le D-xylose et le α-méthyl-D-glucoside alors que C. albicans les assimile dans la plupart des cas. Les galeries API C Aux et ID 32 C incluent désormais le profil d’assimilation des sucres de C. dubliniensis dans leur bases de données (Tintelnot et al., ; Pincus et al., 99). L’étude d’Ellepola et al. utilisant la galerie API C Aux a montré que l’assimilation de D-xylose et de α-méthyl-Dglucoside est négative pour des isolats de C. dubliniensis et positive pour des isolats de C. albicans (Ellepola et al., 3). Le test d’agglutination au latex de Bichro-Dubli (Fumouze diagnostics) a été développé. Sa capacité à identifier les colonies de C. dublinensis développées sur différents milieux (Sabouraud dextrose agar, CHROMagar…) a été évaluée. La sensibilité de ce test varie entre Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 36 97,1 % et % et sa spécificité est de % (Marot-Leblond et al., 6 ; Sahand et al., 6). Plusieurs méthodes moléculaires sont utilisées pour la distinction entre les deux espèces à savoir l’amplification spécifique et /ou le séquençage de la région ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2); la PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Lors de la réalisation de cette méthode, la région ITS de C. dubliniensis est digérée par l’enzyme de restriction B1nI alors que celle de C. albicans reste intacte (Neppelenbroek et al., 6 ; Al-Sweih et al., 5 ; Mahnss et al., 5 ; Mirhendi et al., 5). 

Candida africana 

Candida africana est une espèce récemment identifiée comme responsable des vaginites. Elle possède certaines caractéristiques morphologique et physiologique semblables à C. albicans. Les caractéristiques culturales de C. africana sont semblables à celles de C. albicans. Cependant, elle donne un test de filamentation positif comme C. albicans, mais ne produit pas de chlamydospores (Nnaemeka et al., ). Les méthodes d’identification conventionnelles ne la distinguent pas véritablement de C. albicans, bien que les souches jusqu’ici isolées n’assimilent pas la glucosamine et la N-acetylglucosamine. C. africana a été jusqu’ici isolée uniquement des prélèvements vaginaux des femmes non immunodéprimées, et le milieu vaginal semble être la niche écologique principale de cette nouvelle espèce (Orazio et al., 8). Depuis la découverte du gène Hwp1 comme principal outil d’identification de C. africana, la levure a été isolée dans plusieurs pays et semble avoir une distribution mondiale (Romeo and criseo, 9). Cette espèce a déjà été isolée chez les patients au Nigéria (Nnaemeka et al., ), à Madagascar, en Angola , en Allemagne (Andeme et al., ; Tietz et al., 2), en Italie (Andeme et al., ; Orazio et al, 8). 

Candida glabrata 

Candida glabrata est une levure haploïde, connue auparavant sous le nom de Torulopsis glabrata. Cette espèce ne présente pas de dimorphisme et aucune activité de mating n’a été encore observée. C. glabrata appartient au règne des champignons, au phylum des ascomycètes, à la classe des hémiascomycètes, à l’ordre des saccharomycétales, à la famille des Diversité génétique d’isolats de Cryptococcus et Candida issus des patients VIH+ à Yaoundé et étude de leur sensibilité aux antifongiques et aux extraits de plantes Thèse de Doctorat PhD rédigée et soutenue par Ngouana Kammalac Thierry 37 Saccharomycetaceae, et au genre Candida (Correia et al., 6 ; Alcoba-Florez et al., 5; Kurtzman, 3 ; Mannarelli et al., 98). C. glabrata est une petite levure (2-4μm) qui se présente uniquement sous la forme de blastoconidies aussi bien in vitro qu’in vivo. Elle se reproduit par bourgeonnements successifs et, à ce jour aucune reproduction sexuée n’a été mise en évidence pour cette espèce. Elle pousse à 37°C et les colonies sont blanches, crémeuses, plates et brillantes. Les levures sont rondes ou ovalaires de petite taille et ne donnent pas de pseudomycélium. Cette levure ne pousse pas sur milieu à l’actidione, ne fermente et n’assimile que 2 sucres, le glucose et le tréhalose (Correia et al., 6 ; Alcoba-Florez et al., 5). Peu d’études référencées ont rapporté la présence de C. glabrata dans l’environnement ou chez les animaux. Sa présence dans des zones proches de l’habitat humain peut être interprétée comme une « contamination » de l’environnement par l’Homme (Ferreira et al., ; Brinkman et al., 3). C. glabrata est un pathogène opportuniste du tractus urogénital et peut causer une candidémie (Bolotin-Fukuhara and Fairhead, ; Mannarelli et al., 98). Elle est isolée lors de candidoses vaginales et digestives (Brockert et al., 3 ; Jacobson, ). La prévalence de l’isolement de C. glabrata au niveau du tube digestif est très variable allant de % à 51% (Hedderwick et al., ; Vazquez et al., 98). L’isolement de C. glabrata au niveau vulvovaginal est rapporté depuis les années 7 avec une prévalence variant de ,8% à 8% selon le pays et la population étudiée (Gross et al., 7 ; Dan et al., 6 ; Pirotta et al., 6; Ribeiro et al., 1 ; Lachke et al., ). Pour ce qui est de la pathogénicité, C. glabrata possède des gènes codant pour des phospholipases (Butler et al., 9 ; Kantarcioglu et al., 2 ; Lachke et al., 2).