Etude de l’interaction de dendrimères phosphorés avec les monocytes humains

Caractéristiques des dendrimères 

Propriétés physico-chimiques et méthodes d’analyses 

Suivant le type de synthèse et avec la diversité des groupements chimiques utilisés aux différents niveaux de la molécule (cœur, branches, fonctions terminales), il existe à ce jour un très grand nombre de dendrimères différents. Toutes ces molécules ont des propriétés physiques et chimiques dépendantes de leur structure, qu’il a fallu mesurer, analyser et comprendre. 

 La composition chimique

 Des dendrimères aux compositions chimiques différentes sont utilisés dans le domaine de la biologie. En tenant compte de leur composition chimique interne, il est possible de les classer en plusieurs familles34 (Figure 8). Figure 8 : Exemples de branches utilisées en routine pour la synthèse de dendrimères PAMAM, PPI, PLL ou Phosphorés . La famille de dendrimères la plus utilisée en biologie comporte une structure aminée. Ces dendrimères sont composés de groupements Poly(AMidoAMine) et sont couramment appelés des PAMAMs. Ils sont généralement synthétisés à partir d’un cœur éthylènediamine et comportent des branches issues du méthyl-acrylate et d’éthylènediamine. La plupart de ces dendrimères ont des groupements de surface carboxylate ou amine. Ils sont principalement synthétisés par synthèse divergente et peuvent atteindre la 10ème génération . D’autres dendrimères appelés PPI sont basés sur un cœur de diaminobutane et de branches de Poly(Propylène Imine). Les dendrimères phosphorés quant à eux comportent des atomes de phosphore situés aussi bien au niveau du cœur que des branches, voire même au niveau de leurs fonctions terminales . Les dendrimères de type carbosilane comprennent un cœur composé de groupements silanes et des groupements ammonium ou amine à leur périphérie39 . La famille des Poly-L-(lysine) (PLL) est comme leur nom l’indique constituée en grande partie de lysines40 . Enfin, plus récemment des dendrimères basés autour de groupements polyesters, de polypeptides ou de triazine ont vu le jour41 . Chaque étape de leur synthèse est suivie en routine par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)42. D’autres techniques permettent aussi de caractériser les dendrimères comme la spectrométrie de masse. L’ajout de chromophores peut être aussi confirmé par analyse du spectre d’absorption de la molécule.

La multivalence 

L’ajout des fonctions terminales termine la synthèse des dendrimères construits par la méthode divergente. Il est possible de suivre cette réaction par RMN mais aussi par spectroscopie Infra-Rouge (IR)42. Enormément de groupements chimiques différents ont été utilisés comme fonctions terminales. Ils sont responsables de la plupart des paramètres physico-chimiques de la molécule. Ces fonctions terminales forment à l’extérieur de la molécule une gaine de groupements fonctionnels interagissant avec l’environnement qui les entoure. Les dendrimères sont des entités multivalentes. Ils offrent une possibilité de multiprésentation de monomères Y qui permet d’obtenir une affinité supérieure à la somme des affinités de chacun des monomères. Sur le principe de « l’union fait la force », cette nouvelle notion d’affinité pour cette famille de ligands multivalents sur leurs récepteurs est appelée avidité44 . Les dendrimères peuvent alors se fixer sur des types de récepteurs inadaptés pour des monomères. Des récepteurs composés de plusieurs oligomères. Des récepteurs comportant plusieurs sites actifs ou différentes sous-unités. Des récepteurs présents en un même endroit géographique sous forme de cluster. Des récepteurs nécessitant plusieurs liaisons successives. Figure 9 : Mécanismes de liaison possible d’un ligand multivalent sur un récepteur

 Le coefficient de partition 

Une propriété importante des dendrimères est la notion d’hydrophobicité/hydrophilicité. Cette notion permet d’appréhender la solubilité d’une molécule. Cette donnée peut se mesurer en utilisant une expérience dite de Log de P 46. La molécule va être mise en solution dans un mélange d’eau et d’octanol. L’affinité de la molécule pour l’un ou l’autre solvant déterminera son hydrophobicité. Suivant les groupements présents en surface, il est alors possible de rendre hydrosoluble une cavité hydrophobe permettant l’encapsulation de molécules afin d’augmenter leur solubilité dans les solvants organiques.

 La charge 

La charge d’un dendrimère est principalement due à ses fonctions périphériques. En solution, la cage de solvatation détermine si la molécule a une charge globale positive, négative ou neutre. Cette charge globale peut être déterminée par la mesure de son potentiel zêta. Ce potentiel correspond à la charge globale des molécules en solution. En fait, une double couche ionique existe autour de chaque particule. Une première couche appelée couche de Stern, correspond aux ions fortement liés aux fonctions périphériques chargées. Une seconde enveloppe située à l’extérieur de la couche de Stern comprend des ions moins fortement rattachés. La valeur de charge présente au niveau de cette seconde couche correspond au potentiel zêta (Figure 10). Figure 10 : Couches successives d’ions entourant une molécule et potentiel zêta (ɺ). http://www.coriolis-pharma.com/contract-analytical-services/zeta-potential/ Techniquement, une dispersion de l’échantillon va être introduite au sein de l’analyseur. Il s’agit d’une cellule comprenant deux électrodes situées aux deux extrémités de la cuve. L’échantillon va être soumis à un champ électrique. Les particules vont alors migrer vers l’électrode comportant une charge opposée à leur potentiel. Cette vitesse de migration appelée mobilité va être mesurée et transformée par un modèle d’équation en potentiel de charge. La mobilité étant liée à la charge globale des particules, une moyenne des potentiels zêta des molécules en solution est alors calculée.Suivant la charge du dendrimère, ses interactions avec d’autres composants comme les membranes cellulaires, l’ADN ou les protéines vont être différentes. Des études montrent que leur effet peut dépendre de la charge de la molécule 49,50. En faisant varier la charge globale d’un dendrimère, des différences de pénétration tissulaire ont aussi été observées . Inversement, la mesure de la charge du dendrimère permet aussi de connaître la composition de la couche externe de la molécule. Certaines études utilisent des titrations via le potentiel de charge pour déterminer le nombre d’amines primaires présents en surface du dendrimère.

La taille et le poids moléculaire 

Le bon contrôle de la synthèse chimique des dendrimères permet de prévoir leur taille. La taille d’un dendrimère varie de 2 à 3 nm à plus de 10 nm, avec un ratio de 1 nm ajouté à chaque génération de dendrimère PAMAM (Figure 11). Figure 11 : Relation entre génération et taille d’un dendrimère PAMAM . Il est également admis que la masse moléculaire double pratiquement à chaque génération selon le type de branches utilisé54 . La possibilité pour un solvant de pénétrer au sein de la molécule joue un rôle important dans la détermination de la taille du dendrimère en solution Il est aussi possible de connaître la  dispersité d’un échantillon de molécules en solution, à savoir si les dendrimères sont présents en particules uniques ou sous forme agrégée. Les techniques utilisées en pratique sont la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la RMN, ou encore les techniques de diffraction de la lumière comme le SAXS (Small Angle X-rays Scattering, diffusion des rayons X aux petits angles) ou le SANS (Small Angle Neutron Scattering)42 . La DLS est la technique la plus utilisée en routine. La taille d’un dendrimère en solution représente le diamètre moyen de toutes les molécules diffusant au sein de l’échantillon analysé. Les dendrimères, comme toute molécule en solution, se déplacent selon un mouvement aléatoire appelé mouvement Brownien. Cette vitesse est utilisée pour déterminer leur taille. La relation entre taille et vitesse des particules est donnée par la relation de Stokes-Einstein. Plus la molécule est de taille importante, plus son mouvement sera lent. Cette équation permet d’obtenir une moyenne des diamètres hydrodynamiques des molécules en solution (Figure 12) .