Evaluations de réactif et de lignée cellulaire

Utilisation du milieu 2i+LIF

D’après mes résultats, par comparaison avec une culture en milieu avec sérum une culture en milieu 2i permet d’augmenter les expressions des PAL, de Nanog et d’Oct4 puis de Sox2 (figure n°46, 47 et 48). De nombreuses études ont démontré que des cellules pluripotentes cultivées en milieu 2i, ont une augmentation de leur expression du facteur de transcription Nanog (Abranches et al., 2014 figure n°1 et 2 ; Wang et al., 2017 figure n°3 ; Faunes et al., 2013 figure n°6 ; Muñoz Descalzo et al., 2012 figure n°1). L’inhibiteur PD0325901 dirigé contre la voie MEK/ERK, contenu dans le milieu 2i diminue l’hétérogénéité de l’expression de Nanog d’une part en favorisant son expression par toutes les cellules ES et d’autre part en rendant cette expression bi-allélique (Abranches et al., 2014 figure n°3, Wray et al., 2010 figure n°3 ; Miyanari and Torres-Padilla, 2012 figure n°2 ; Faddah et al., 2013 figure n°1 et 2). L’augmentation des expressions des PAL (Sim et al., 2017 figure n°1 ; Faunes et al., 2013 figure n°2) et des facteurs de transcription Oct4 et Sox2 ont également été reportés (Alexandrova et al., 2016 figure n°1, Muñoz Descalzo et al., 2012 figure n°1). Les expressions d’Oct4 et Sox2 augmentent moins avec le milieu 2i car leur expression est déjà bi-allélique en milieu contenant du sérum (Miyanari and Torres-Padilla, 2012 figure n°2 ; Faddah et al., 2013 figure n°2). J’ai constaté que l’expression des facteurs NOS est plus hétérogène dans une culture en milieu contenant du sérum que dans une culture en milieu 2i (figure n°48). Cette hétérogénéité, également morphologique, est plus importante en milieu DKO+LIF qu’en milieu 2i+LIF (données non présentées). Cela est connu pour les cellules ES cultivées en milieu avec sérum mais aussi, à moindre mesure, pour les cellules cultivées en milieu 2i+LIF où cette hétérogénéité naturelle est limité par différent inhibiteur mais reste visible. Le milieu 2i permet un accroissement du nombre de chimères (figure n°49 et 50) car les niveaux d’expression des facteurs NOS sont moins hétérogènes et plus proches de l’état naïf de la pluripotence. Les cellules qui expriment faiblement Nanog seraient plus susceptibles de s’engager dans la différenciation contrairement à dont l’expression est élevée, qui se trouvent dans l’état naïf de la pluripotence. Une étude a démontré que les réarrangements cellulaires qui ont lieu dans l’embryon entre les stades 2,5 dpc et 4,5 dpc (figure n°1) excluent les cellules micro-injectées qui ne sont pas au stade naïf de la pluripotence (Alexandrova et al., 2016). Par rapport à des cellules ES cultivées en milieu 2i, les cellules ES cultivées en milieu avec sérum seraient davantage écartées du développement embryonnaire par l’embryon hôte. Bien Evaluations de réactif et de lignée cellulaire 83 que cette étude ait été réalisée sur des embryons au stade 8 cellules (2,5dpc) dans lesquels les cellules ES introduites subissent trois phases de « tri » jusqu’au stade blastocyste (figure n°1), dans nos conditions les ESC sont micro-injectées dans des blastocystes à 3,5 dpc où la troisième phase de réarrangement à lieu. Suite à la micro-injection, les cellules ES exogènes réintègrent l’ICM où les ES endogènes laissent passer les cellules dont la pluripotence est dite « naïve ». Ces cellules exogènes restent alors dans l’ICM et participent au développement de l’embryon en colonisant les lignages précurseurs (endoderme, ectoderme, mésoderme). Selon cette hypothèse les différences de taux de chimérisme observées entre les conditions « DKO », « 2i J2 à J5 » et « 2i J5 à J9 » (figure n°49 et 50) reflètent cette étape d’exclusion des ES micro-injectées par les cellules de l’ICM lors de cette troisième phase de « tri ». Par leurs niveaux d’expression des facteur NOS, les cellules ES cultivées en milieu 2i+LIF seraient plus proches des cellules de l’ICM que le seraient des cellules ES cultivées en milieu DKO+LIF.

Les réactifs de dissociation cellulaire

J’ai observé que la croissance des cellules traitées avec la trypsine était plus faible que celle des cellules traitées avec l’Accutase (figure n°32). Différentes études sur des cellules souches neuronales et sur des hESC ont également montré qu’après dissociation la viabilité et la prolifération des cellules traitées avec la trypsine sont moins importantes que celles des cellules traitées avec l’Accutase ( Wachs et al., 2003 figure n°1; Jager et al., 2016 figure n°3). Les cellules ES humaines sont plus impactées par la trypsine que les mESC. La viabilité des hESC diminue rapidement après dissociation par action de la trypsine et leur prolifération est très faible contrairement aux cellules traitées avec de l’Accutase (Bajpai et al., 2008; figure n°1). De plus, l’Accutase n’induit chez les hESC ni perte d’expression des marqueurs de la pluripotence NANOG, OCT4, SOX2 et SSEA4 (Bajpai et al., 2008; figure n°5) ni perte de leur capacité de différenciation, (Bajpai et al., 2008; figure n°7). L’Accutase permet donc la dissociation des hESC sans affecter leur viabilité, leur prolifération, ni leur pluripotence. Chaque technique de dissociation cellulaire dégrade différents type de molécules transmembranaires dont font parties les récepteurs membranaires et les molécules d’adhésion. La dégradation des récepteurs de facteurs de croissance pourra impacter la survie cellulaire et la prolifération cellulaire tandis que la dégradation des molécules d’adhésion aura un effet sur l’adhésion et la migration cellulaire. Si l’Accutase dégrade moins de récepteurs membranaires que la trypsine, la prolifération des cellules sera plus importante. Si les molécules d’adhésion sont moins dégradées, l’adressage des ES micro-injectées jusqu’au centre de l’ICM pourrait être facilité. Comme c’est le cas pour les hESC, les mESC traitées avec l’Accutase prolifèrent mieux que celles traitées avec la trypsine, cela est en accord avec une colonisation plus rapide de l’ICM du blastocyste après micro-injection, qui se traduit par des taux de chimérismes plus élevés (figure n°51). 84 4.1.3 Comparaison de SVF et de KSR Par comparaison avec un milieu contenant du sérum, le KSR est connu pour faciliter l’établissement de lignées de cellules ES (Lee et al., 2006, table n°1; Cheng et al., 2004, table n°1). Comme les ESC cultivées en présence de sérum, les cellules cultivées en KSR conservent leur pluripotence fonctionnelle (Liu et al., 2014, figure n°4 ;. Cheng et al., 2004, table n°2). J’ai constaté qu’en remplaçant le sérum par du KSR dans notre milieu de culture, les cellules ES ont des expressions de Nanog et Oct4 plus importantes (figure n°37 et 38). Ces observations sont en accord avec l’absence d’inducteurs de la différenciation cellulaire tels que certains facteurs de croissance (Liu et al., 2014; figure n°1). L’un d’eux, le βFGF (FGF-2, FGF-B) active la voie de signalisation MAPK/ERK qui réprime l’expression de Nanog (Liu et al., 2014; figure n°6). L’utilisation du KSR dépourvu de facteurs de croissance favorise donc le système d’autorégulation de la pluripotence des cellules ES. Ce réactif est actuellement utilisé dans la culture de nos cellules souches afin de réaliser des tests de formation de chimères et d’obtention de GLT. Si les résultats fonctionnels sont au moins identiques à ceux obtenus avec des culture en sérum, nous utiliserons le KSR pour réaliser nos prestations dans le but de mieux maitriser la composition de nos milieux de cultures et par conséquent l’état cellulaire de nos mESC.

Etablissement de nouvelles lignées de cellules ES

La lignée ABI1 a un taux de croissance plus important que les autres lignées testées (figure n°40) et présente la meilleure morphologie en culture. Malgré ces observations mes analyses moléculaires n’ont révélé aucune différence significative. Les tests fonctionnels de formation de chimères sont en cours et nous permettrons de conclure sur l’utilisation de cette lignée dans nos prestations. La lignée ABI1, tout comme les autres lignées ABI, a une durée de culture in vitro plus courte que celles des JM8.F6 donc moins de probabilité d’avoir dérivé de leur état natif. Dans le cas de résultat fonctionnel identique à ceux obtenus avec la lignée JM8.F6 utiliser la lignée ABI1 permettrait une meilleure maîtrise de l’état de culture en limitant les risques de différenciation cellulaire et de dérive génétique.

Impact de nos procédures de biologie cellulaire

Bilan sur l’optimisation de nos procédures

Depuis 2011, au cours de l’optimisation progressive de nos procédures de biologie cellulaire, qui ont permis d’augmenter séquentiellement la proportion de souris chimériques, nous constatons une diminution du nombre de naissance. J’ai analysé les taux de naissances annuels de 2011 à 2016 en les reliant à la proportion annuelle de souris chimères pour rechercher un éventuel lien entre le taux de naissance et la capacité de colonisation de l’embryon. 85 Figure n°53 : Relation entre le taux de naissance et la colonisation des embryons Les valeurs présentées sont les taux annuels de chimérisme et de naissance. Ces résultats ont été obtenus en faisant le rapport du nombre total de souris nées dans l’année (souris wild-type et chimériques) sur le nombre total d’embryons micro-injectés et réimplantés dans l’année. Pour les années 2011 à 2016 le nombre « n » d’embryons analysés est compris entre 2680 et 4781. Les lignes en pointillés représentent les modifications apportées à nos procédures de biologies cellulaires : – Ligne 1 (Avril 2012) : utilisation du milieu 2i +LIF pendant 2 à 5 jours avant la micro-injection des cellules ES – Ligne 2 (Juillet 2014) : utilisation du milieu 2i +LIF pendant 6 à 9 jours avant la micro-injection des cellules ES – Ligne 3 (Janvier 2015) : remplacement des SNL à 30 000/cm² par des PMEF à 40 000/cm² – Ligne 4 (courant 2015) : diminution de la densité des PMEF de 40 000/cm² à 20 000/cm² – Ligne 5 (Juin 2016) : augmentation de la densité des PMEF de 20 000/cm² à 40 000/cm² – Ligne 6 (Septembre 2016) : remplacement de la Trypsine 0,05% par l’Accutase pour la dissociation cellulaire A chaque fois que la proportion de chimères augmente, le taux de naissance diminue et inversement. La viabilité des embryons hôtes semble dépendante du niveau de colonisation des cellules ES exogènes. Des études sur la colonisation des embryons de souris par des cellules ES (Alexandrova et al., 2016; Wang and Jaenisch, 2004) ont montrées que les souris chimériques capables de GLT, obtenues à partir de cellules ES cultivées en présence de sérum et dissociées avec de la trypsine, sont issues d’embryons colonisés par seulement 1 à 3 cellules ES parmi les 10-15 cellules utilisées (micro-injection ou agrégation). Le fonds génétique de nos blastocystes hôtes (Balb/c) a été choisi en 2008 en fonction de sa compatibilité avec notre lignée de cellule ES de fonds génétique C57Bl6/N. Dans nos conditions expérimentales, les blastocystes Balb/c étaient assez permissif pour que la micro-injection de 12 cellules ES de fonds génétique C57Bl6/N cultivées en DKO+LIF et traitées avec la trypsine colonisent suffisamment l’ICM puis l’embryon pour donner naissance à une souris chimère capable de GLT. En considérant cela, les souris chimériques de la condition DKO+LIF (figure n°49) seraient issues de seulement 1 à 3 cellules ES parmi les 12 cellules micro-injectées. Depuis l’utilisation du milieu 2i+LIF en 2012 (ligne 1) puis de la prolongation de la sélection en 2i en 2014 (ligne 2) le taux de chimère augmente alors que 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2011 2012 2013 2014 2015 2016 Pourcentage annuel (%) Année Evolution du taux de naissance et de la proportion de souris chimères Naissances (WT et chimères) Proportion de chimères 1 2 3 4 5 6 86 le taux de naissance diminue. Cela indiquerait que davantage de cellules colonisent l’embryon car elles sont dans l’état « naïf » de la pluripotence (Alexandrova et al., 2016). Le bénéfice du remplacement des SNL par des PMEF à 40 000/cm² en 2015 (ligne 3) n’est pas visible car la densité d’ensemencement des PMEF a été diminuer de moitié au cours de la même année (ligne 4). Cette dernière modification a fait chuter la viabilité et la pluripotence des cellules ES (données non présentées) et par conséquent le taux de chimérisme annuel. La colonisation des ES étant moins importante, la viabilité des embryons hôtes était un peu plus élevée qu’en 2014, effet visible sur le taux de naissance annuel. L’utilisation de PMEF à une densité de 40K/cm² et d’Accutase pour la dissociation cellulaire permettent indépendamment d’augmenter la prolifération des cellules ES (données non présentées). Nous avons respectivement appliqué ces conditions dans nos procédures de culture en juin 2016 et septembre 2016 (ligne 5 et 6), les données présentées pour l’année 2016 sont donc la résultante de ces deux changements. Dans ces nouvelles conditions de culture, les cellules qui sont entrées dans l’ICM se propageraient plus rapidement dans les différents lignages cellulaires. La conséquence est une augmentation du taux de chimérisme annuel (données 2016), accompagné d’une chute du taux de naissance.