EXTRACTION DES ACIDES DESOXYRIBONUCLEIQUES (ADN)

Les ADN viraux sont extraits à partir de 200 µl de chaque échantillon, en utilisant le PureLinkR Viral RNA/DNA Mini Kit du fournisseur Invitrogen (California, USA) conformément au protocole du fabricant. Les acides nucléiques sont élués dans un volume de 50 µl et gardés à -80 °C. 

DETECTION DES ADENOVIRUS PAR LA RT-PCR EN TEMPS REEL

La détection des adénovirus a été faite par la technique de la PCR en temps réel. La réaction PCR à temps réel a été faite en utilisant le kit Anyplex II RV16 du fournisseur Seegene. C’est un kit qui permet de détecter 16 différents virus respiratoires dans une seule réaction. La réaction se répartit en 2 panels (A et B). Les adénovirus sont détectés dans le panel A. Pour chaque panel le volume réactionnel se compose comme suit : 18 Tableau III : Réaction pour les panels A et B IV. CARACTERISATION MOLECULAIRE DES ADENOVIRUS La caractérisation moléculaire des AdV respiratoires a été faite par la technique de la PCR (Polymerase Chain Reaction) classique. La PCR cible un court fragment (380 pb) dans la région hexonique du génome. Les amorces Adeno 3 et Adeno 4 (tableau 4) et l’enzyme Phusion High Fidelity PCR Master Mix du fournisseur Biolabs ont été utilisées pour l’amplification de la cible. Parmi 5338 échantillons, nous en avons testés 150 pour cette présente étude. Nous avons choisi des échantillons positifs en Adénovirus en privilégiant ceux détectés au bout de 8 cycles de PCR en tenant compte des différentes périodes de circulation (pour une meilleure couverture temporelle). Ainsi les amplicons obtenus après PCR sont envoyés pour un séquençage afin de faire une analyse phylogénétique. L’arbre phylogénétique a été construit grâce aux séquences nucléotidiques. Les séquences HAdV disponibles dans GenBank ont été utilisés en tant que génome de référence. La version MEGA 5 a été utilisé pour la construction de l’arbre phylogénétique basé sur la méthode de NeighborJoining (NJ) en utilisant le modèle à distance de deux des paramètres de Kimura, avec 1000 répliques bootstrap. Tableau IV: Séquence des amorces utilisées pour la PCR Classique Amorces Tm séquences Position Adeno 3 (sens) 62,5 °C 5’-CCT TTG GCG CAT CCC ATT CT-3’ 687 – 706 Adeno 4 (anti sens) 62,7 °C 5’-GCG CTT GTC ATA GGT GCC CA-3’ 21825 – 21806 4X RV16 buffer 2,5 µl Anyplex PCR Master Mix 2,5 µl Rnase-free Water 1 µl cDNA 5 µl Volume total 11 µl 19 Le mix réactionnel est le suivant : Réactifs pour le mix Pour 1 tube Nuclease free DNA 15 µL Primer Forward (10 µM) 2,5 µL Primer Reverse (10 µM) 2,5 µL 2X Phusion Master Mix 25 µL Template DNA 5 µL Volume total 50 µL Le programme utilisé avec le thermocycleur (DNA Engine, Tetrad 2, Peltier Thermal Cycler, numéro de série : AL103371, BioRad) est le suivant : ETAPE TEMPERATURE DUREE CYCLES Dénaturation initiale 98°C 30 secondes 1 Dénaturation 98°C 10 secondes Hybridation des amorces 60°C 30 secondes 40 Elongation 72°C 30 secondes Elongation terminale 72°C 10 minutes 1 Fin 4°C indéterminée Chaque produit d’amplification (7µl de chaque échantillon) est visualisé sur un gel d’agarose à 2% par électrophorèse (migration à 100 volts pendant 50 mn). Le gel est coloré par une solution de bromure d’éthidium (BET) à une concentration de 0.5µg/ml puis visualisé sous ultra-violet (UV). Les échantillons qui apparaissent avec une bande nette sont considérés comme positifs et sont conservés à -20 °C. Ces produits PCR sont ensuite quantifiés au NanoDrop (Thermo Scientific NanoDrop Lite Spectrophotometer, Madison, WI, Made in USA conforme to STD. UL61010-1 Cert. To CSA Std. C22.2#61010.1) avant un envoi en séquençage. Les séquences obtenues sont analysées avec les outils bioinformatiques BioEdit v7.0.5, GeneStudio v2.2.0.0 (pour les alignements) et Mega 5 (pour l’analyse phylogénétique).