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Système FRET du terbium vers la SiR-méthyl
Les protéines ZIFZn(Tb(DO3ApicAr1)) et ZIFZn(SiR-méthyl) ont été dissoutes dans un mélange HEPES pH 7,5/BSA/Tween/NaCl (15 mM, 0,1 g/L, 0,05 %, 100 mM) en rapport 1:1 à une concentration de 1 µM et étudiées comme précédemment. Les résultats sont assez similaires à ceux obtenus avec la lissamine et nous ne détaillerons donc pas autant l’étude.
Le spectre d’émission obtenu en excitant à 306 nm est représenté dans la Figure 155 (Bas). On reconnaît parfaitement l’émission du terbium avec ses 4 bandes caractéristiques à 490, 545, 585 et 623 nm et celle de la SiR-méthyl vers 675 nm. Cette attribution est confirmée sans ambiguïté par les spectres d’excitation obtenus en excitant à 545 et 675 nm. On peut noter que contrairement au couple Tb/lissamine, le couple Tb/SiR-méthyl présente des spectres d’émissions qui se recouvrent peu, ce qui sera un avantage pour la quantification du ratio d’émission SiR-méthyl/terbium. Comme la lissamine, la SiR-méthyl absorbe à 306 nm et son émission à 675 nm est au moins en partie due à l’excitation directe de ce chromophore. Le spectre d’émission résolu en temps (délai = 100 µs) laisse apparaître une faible contribution de la SiR-méthyl vers 675, indiquant une part de transfert provenant du terbium vers la SiR-méthyl (Figure 156 A ; 0 eq.). Ceci est confirmé par le temps de vie de luminescence du terbium (2,18 ms), inférieur à celui de la protéine ZIFZn(Tb(DO3ApicAr1)) seule.
Conclusion
La détection de l’ADN basé sur l’étude d’un FRET du terbium vers la lissamine n’est pas très efficace à cause de l’excitation directe de la lissamine lors de l’excitation du complexe de terbium, conduisant à une forte contribution indépendante de la présence d’ADN au signal de la lissamine. La faible efficacité du transfert d’énergie entre le terbium et la lissamine dans ce système ne permet pas de compenser cela et d’avoir une détection sensible. En remplaçant la lissamine par la SiR-méthyl, qui présente un spectre d’émission à plus basse énergie, de 635 à 735 nm, on améliore la détection de l’ADN. Cependant l’excitation directe de la SiR-méthyl lors de l’excitation du complexe de terbium réduit ici encore la sensibilité du système. Il faudrait donc pouvoir utiliser une longueur d’onde d’excitation plus élevée, vers 350 nm, à laquelle l’absorption de la SiR-méthyl est plus faible. Le complexe d’europium [Eu(DO3ApicAr2)]-(λex= 345 nm) pourrait dans ce cas être un donneur parfaitement adapté.
FRET de l’europium vers un fluorophore
Les paramètres photophysiques de l’europium étant compatibles avec ceux de la SiR-méthyl pour un FRET d’un lanthanide vers un fluorophore, nous avons entrepris la synthèse d’une nouvelle protéine notée ZIF(Eu(DO3ApicAr2)).
1) Travaux préliminaires
Avant de travailler avec le complexe [Eu(DO3ApicAr2)]- et de chercher à l’intégrer sur une protéine servant de sonde à ADN,
nous avons travaillé sur d’autres systèmes incorporant le même type d’antenne « picoline-alcyne-aryl » permettant de sensibiliser l’europium (Figure 158). Les détails du système
n’étant pas en rapport avec le sujet de thèse, seules les observations et conclusions qui en ont été tirées seront présentées.
i Ligation en conditions classiques
Une ligation entre un peptide cystéinyl et un peptide SEAoff comportant un chromophore
« picoline-alcyne-aryl » a été réalisée dans des conditions classiques (MPAA 100mM, TCEP 100mM, tampon phosphate 100mM, pH 7,5), puis analysée par spectrométrie de masse. Le produit de ligation a été obtenu avec une masse M+168, correspondant à l’addition d’une molécule de MPAA sur la fonction alcyne du chromophore (Figure 159). L’utilisation de MPAA pour les ligations avec des molécules comportant les dérivés de l’antenne « picoline-alcyne-aryl » est donc problématique en raison de la réaction d’hydrothiolation des triples liaisons, réaction connue et décrite dans la littérature[185].
Figure 159: Addition du MPAA sur l’alcyne dans des conditions classiques de ligation Sondes de seconde génération, FRET d’un lanthanide vers un fluorophore La diminution de la concentration de MPAA conduit à une cinétique de réaction plus lente sans empêcher la formation du produit d’addition de MPAA sur l’alcyne. L’utilisation d’autres thiols moins acides a été envisagée, en testant le MPA ou le MesNa, qui ont montrés la même réactivité vis-à-vis de l’alcyne. On en conclut donc que les chromophores comportant des fonctions alcyne ne doivent en aucun cas être mis en présence de thiols acide et que l’utilisation du complexe [Eu(DO3ApicAr2)]- est compromise.
ii Changement des conditions de ligation
Pour contourner ce problème, nous avons repris les travaux de T. Yoshiya, qui a décrit la possibilité de substituer le MPAA par de l’imidazole[186] ou du 1,2,4-triazole[187], ce dernier substitut permettant une réaction rapide, l’intermédiaire acyl-triazole étant moins sensible à l’hydrolyse.
L’introduction du peptide conjugué au chromophore « picoline-alcyne-aryl » dans les conditions de ligation décrite par T. Yoshiya (imidazole ou triazole 2,5M dans un tampon phosphate 100 mM pH 7,5), n’a montré aucune trace d’addition d’une quelconque molécule sur le peptide.
La ligation entre le peptide cystéinyl et le peptide SEAoff comportant un chromophore
« picoline-alcyne-aryl » dans les conditions de T. Yoshiya a permis d’assembler les deux
fragments peptidiques sans réaction parasite (Figure 160).
Figure 160: Ligation au triazole avec un peptide comportant un chromophore alcyné
Pour mener à bien la synthèse de la protéine désirée, il faut donc pouvoir adapter la stratégie de double ligation one-pot décrite par O. Melnyk[115] avec ces nouvelles conditions. Pendant la première ligation, le MPAA sert lors de l’étape de transthioesterification pour former le
thioester de MPAA, mais il joue également le rôle de réducteur sélectif des groupements protecteur StBu des cystéines. Sans la déprotection de ces cystéines, aucune réaction de ligation ne peut avoir lieu. La stratégie de O. Melnyk n’est donc pas envisageable en substituant le MPAA par du triazole. La seconde ligation, elle, ne poserait aucun souci, car s’effectuant dans des conditions réductrices. Le talon d’Achille de cet assemblage réside donc dans la protection StBu de la cystéine en N-terminal du fragment central.
2) Mise en place d’une nouvelle voie de synthèse de protéines
Une nouvelle stratégie est nécessaire, évitant l’utilisation d’une cystéine protégée par un groupement StBu pour la synthèse du fragment 2. Pour rappel, la protection de la cystéine finale sur le fragment 2 permet d’éviter son oxydation lors du passage du SEAon au SEAoff. Une alternative pourrait être de changer de groupement protecteur en utilisant par exemple une thioproline. Cependant, comme observé au chapitre I (p.64), le fragment 2 comportant une cystéine cyclisée en N-terminal n’est que très peu soluble lors de l’étape d’oxydation en milieu aqueux acide.
Une alternative à la stratégie SEA est donc nécessaire en changeant la fonction située en C-terminal du fragment 2. Pour cela, nous nous sommes intéressés au crypto-thioester N-HNB-Cys(StBu) développé par l’équipe de V. Aucagne[188], dont le principe reste le même que pour le crypto-thioester SEA tout en étant bien moins coûteux.
A Utilisation de la résine HNB
i Principe
Le crypto-thioester N-HNB-Cys(StBu) (Figure 161) est composé d’une cystéine dont le thiol est protégé par une fonction StBu, et comportant un groupement HydroxyNitroBenzyl (HNB) sur sa fonction amine. Cette cystéine est liée à la résine par une glycine en C-terminal, servant de bras espaceur. Le peptide est synthétisé à partir de l’amine secondaire de la cystéine protégée.
Table des matières
REMERCIEMENTS
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES ABRÉVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTES DES TABLEAUX
AVANT-PROPOS
INTRODUCTION
I. LES ANEVRISMES INTRACRANIENS
1. Données cliniques
A. Epidémiologie
B. Traitements préventifs de la rupture d’AIC
C. Facteurs de risque d’AIC
a. Facteurs de risque de survenue d’AIC
b. Facteurs de risque de rupture d’AIC
2. Physiopathologie des AIC
A. Spécificité des artères cérébrales
a. Histologie
b. Hémodynamique
B. Remodelage de la paroi au niveau de l’AIC
a. Description générale de la paroi de l’AIC
b. Rôle des contraintes hémodynamiques et de l’endothélium dans la formation des AIC
c. Rôle des CMLV dans la formation des AIC
d. Rôle des cellules inflammatoires dans la formation des AIC
C. Intérêt des modèles animaux dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques des AIC
3. Prédispositions génétiques aux AIC
A. AIC syndromiques
B. AIC non syndromiques
a. Analyses de liaison
b. Approche gène candidat
c. Etudes d’association pangénomiques
d. Séquençage d’exome entier dans des formes familiales
II. ANGPTL6
1. Structure protéique des angiopoiétines-like
2. Rôle vasculaire des angiopoiétines-like
3. ANGPTL6
III. CTSO
1. Généralités sur les cathepsines
A. Structure protéique et classification.
B. Activation des cathepsines
C. Rôles physiologiques des cathepsines
a. Rôles des cathepsines dans le lysosome
b. Rôle des cathepsines dans le cytosol
c. Rôle des cathepsines dans le milieu extracellulaire
2. Rôles des cathepsines dans les pathologies cardiovasculaires
A. Rôle des cathepsines dans le remodelage vasculaire
B. Rôle des cathepsines dans l’AIC
3. CTSO
OBJECTIFS
RESULTATS
I. PROJET ANGPTL6
1. Introduction
2. Matériels et méthodes
A. Modèle animal
a. Modèle d’HTA
b. Modèle chirurgical d’induction des AIC
B. Perfusions intracardiaques
C. Immunofluorescence / Transparisation
D. Imagerie
a. Tomodensitométrie
b. Imagerie confocale
c. Microscopie à feuille de lumière
E. Artériographie pressurisée
F. Culture cellulaire
a. Test d’adhésion cellulaire par mesure d’impédance
b. Evaluation de la migration
c. RT-qPCR
d. Western blot
e. Contraction sur gel de collagène
G. Analyses statistiques.
3. Résultats
A. Les souris Angptl6-KI présentent un défaut de couverture en CMLV lors de l’angiogenèse rétinienne
B. ANGPTL6 favorise l’adhésion des CMLV et diminue leur migration
C. ANGPTL6 n’affecte pas le phénotype des CMLV mais augmente leur contractilité
D. Les souris Angptl6-KI présentent un défaut de compliance et une dysfonction endothéliale des artères cérébrales
E. Les souris Angptl6-KI présentent une augmentation de diamètre des artères cérébrales et des déformations localisées
F. Les souris Angptl6-KI semblent avoir une susceptibilité aux déformations de la paroi au niveau des bifurcations des artères cérébrales
4. Discussion
II. PROJET CTSO
1. Préambule
2. Manuscrit
CONCLUSION – DISCUSSION
I. CONCLUSION
II. DISCUSSION GENERALE
REFERENCES
ANNEXES
