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Susceptibilité et résistance aux maladies infectieuses

Qu’est ce qu’un individu résistant ?

La résistance à une maladie peut être définie par la lutte efficace permettant de survivre dans un environnement hostile composé de stress de nature biotique ou abiotique. Les individus d’une même pop ulation répondent indépendamment les uns des autres aux stress par leur capacité à faire face à la maladie. Chaque individu a alors sa propre susceptibilité pour une maladie donnée. La susceptibilité élevée décrit l’état d’une sensibilité alors que la susceptibilité très faible, voire inexistante, définira une résistance à la maladie.
L’animal dit résistant à une maladie ne présentera pas de symptômes. La susceptibilité n’est pas gouvernée uniquement par ’immunitél mais également par le comportement des individus des populations exposés aux agents pathogènes. Ces comportements peuvent être illustrés par exemple par des alimentations différentes qui découlent directement de l’environnement.
L’origine de la résistance à une maladie est souvent génétique. La notion de l’exploitation de la variabilité génétique des bivalves résistants à des agents pathogènes est commentée par Quillet et ses collaborateurs (2007).
Dans notre étude, la résistance de la maladie de ’anneaul bun est représentée soit par des palourdes apparaissant asymptomatiques (porteur sain de V. tapetis). soit par des palourdes arrivant à réparer totalement la coquille après avoir lutté contre la bactérie.

Sélection génétique d’animaux résistants

Les études sur des capacités de résistance à des maladies sont nombreuses chez les invertébrés du fait de leur importance économique. La sélection des populations les plus résistantes ou les moins susceptibles se fait par pression de sélection en exposant les populations aux agents pathogènes soit en milieu contrôlé en laboratoire soit en milieu naturel déjà contaminé par l’agent infectieux responsable de la maladie.
En milieu contrôlé, et particulièrement dans le secteur de l’aquaculture, les sélections ont alors pour fonction de faire disparaître les populations ou les individus les plus sensibles au profit des populations à potentiel résistant aux maladies afin de satisfaire le développement économique. Alcivar-Warren et ses collaborateurs (1997) ont décrit des origines génétiques de la susceptibilité des crevettes Penaeus vannamei au virus Baculovirus penaei grâce à la réalisation des croisements.
La moule, Mytilus galloprovincialis semble moins sensible que les huitres et les palourdes face aux vibrioses (Mar Costa et al., 2008). Elle est très étudiée afin de comprendre quels agents immunitaires sont responsables de cette meilleure tolérance (Venier et al., 2011). Des études comparatives entre la moule et l’huître face aux vibrioses sont en cours dans le cadre d’un Programme Européen Bivalife (2011-2013), coordonné par T. Renault auquel l’équipe IHP du LEMAR (Plouzané) participe. Par ailleurs, des sélections par croisement d’huîtres plates résistantes à Bonamia orrespondantc à une plus forte survie par rapport à des populations standard ont été entreprises (Naciri-Graven et al., 1998, Culloty et al., 2004).
La modulation de la microflore comme l’utilisation de probiotiques apporte une autre forme de résistance. Elle permet en milieu de culture contrôlé d’induire la résistance à la vibriose des crevettes de Nouvelle-Calédonie Litopenaeus stylirostris (Castex et al., 2010).
Des critères de résistance sont étudiés chez les bivalves. Plusieurs populations d’huîtres plates ont été confrontées àBonamia afin de comparer leur résistance (da Silva et al., 2008). De nombreux travaux ont été entrepris sur les populations d’huîtres creuses sujettes auxmortalités estivales. Par la génétique, des programmes de sélection à grande échelle sont réalisés par identification de critères de résistance aux pathogènes. Ainsi, des familles résistantes et sensibles ont été sélectionnées au oursc du défi MOREST (Samain et Mc Combie, 2007). Un lot suggéré comme résistant à la mortalité estivale chez C. gigas montre depuis 6 générations une plus faible mortalité que les lots témoins et sensibles (Cochennec-Laureau et al., 2011) dont le caractère de résistance semble héréditaire. De plus, Dégremont et ses collaborateurs (2010) ont montré la résistance d’huîtres juvéniles face à l’herpes-virus.
La détermination de QTL a permis d’identifier des marqueurs associés à des gènes de résistance à Bonamia chez O. edulis (Lallias et al., 2009a) et des gènes de survie chez C. gigas (Sauvage et al., 2010) ainsi que des QTLs liés à la résistance à la maladie MSX chez l’huîtreC. virginica (Yu et Guo, 2006). La sensibilité à la vibriose par le V. splendidus et V. aesturianus semble liée à des bases génétiques chez l’huître creuse (De Decker, 2010). Des injections de Vibrio en laboratoire ont permis d’obtenir des taux de survie supérieurs dans les familles issues d’huîtres dites résistante par rapport aux familles issues d’huîtres dites sensibles.
Dans les années 1970, une population d’huîtres Crassostrea virginica résistante au parasite Haplosporidium nelsoni (MSX) a été identifiée (Haskin et Ford, 1978). Des études comparatives sur les concentrations en protéines de l’hémolymphe de populations résistantes et susceptibles ont été décrites (Ford, 1986).
Une autre espèce d’huîtres, l’huître australienneCrassostrea glomerata est étudiée grâce à des programmes de sélection pour la résistance à la marteliose QX (Simonian et al., 2009 ; Dang et al., 2011).
L’étude de populations sur différents critères de usceptibilité à la bonamiose permet de mieux comprendre comment les animaux se défendent face aux attaques pathogéniques et de trouver, grâce à la génomique, des gènes associés à la résistance tels que celui de la cathepsine surexprimé dans les hémocytes d’individus résistants exposés àBonamia (Morga et al., 2011). La majorité des études de sélection concernent les huîtres. Des études sur la palourde japonaise nécessitent d’être approfondies afin de mieux identifier des animaux résistants à la maladie de l’anneau brun ou MAB (voir section Modèle biologique) dans le but de relancer la production vénéricole française. En effet, une première approche de sélection a étéentreprise depuis le début des années 2000 après avoir montré que un lot de palourdes cultivé alors dans le Morbihan développait beaucoup moins les symptômes de la MAB que les autres lots cultivés (Soudant et al, 2004). Depuis, des populations successives à partir de ce lot moins sensible ont été produites. La production de familles biparentales à partir d’individus de ce lot permettrait alors de mieux comprendre l’origine génétique de la sensibilité à la MAB. Afin de sélectionner des géniteurs suivant leur caractère plus ou moins sensibles à la MAB des critères physiologiques sont mesurés.

Biomarqueurs pour la sélection d’animaux résistants

Les biomarqueurs se définissent par des paramètres biochimiques, moléculaires, cellulaires, physiologiques ou comportementaux pouvant être  mesurés suite à un stress au niveau des organismes entiers, au niveau tissulaire ou au niveau des fluides.
Pour notre étude, la nature du stress est l’infection par V. tapetis. Les paramètres choisis concernent principalement ceux impliqués dans la défense immunitaire et donc ceux en relation avec les hémocytes et le plasma dans lequel ils baignent. Dans les populations de R. philippinarum européennes et de la côte est des Etats-Unis, des paramètres hémocytaires ont été rapportés dans diverses études liées à la MAB, suite ou non à une inoculation de V. tapetis, sur le terrain ou en laboratoire (Paillard et al., 1994, 1995 ; Oubella et al., 1993, 1994, 1996 ; Ford et Paillard, 2007 ; Allam et Paillard, 1998, Allam et al., 2000a, 2000b, 2001, 2002a, 2006 ; Reid et al., 2003 ; Flye Sainte-Marie et al., 2007a, 2009a). Plus récemment une étude a montré une différence de susceptibilité face à la MAB sur plusieurs générations entre deux stocks aquacoles de palourdes japonaises (Trinkler et al., 2010). Les biomarqueurs recherchés concernent ceux impliqués dans la résistance à la MAB associés soit à des capacités de lutte contre la bactérie sans qu’il y ait de développement de symptômes soit à des capacités de réparation coquillière ou guérison.
A ce jour, aucune donnée sur les paramètres hémocytaires n’a été apportée au niveau individuel sur des populations de palourdes d’écloserie à susceptibilité différentielle face à la MAB.

Les hémocytes

Chez les invertébrés, l’hémolymphe participe à différents processus physiologiques : digestion, transport de métabolites, réparation coquillière (Mount et al., 2004 ; Trinkler et al., 2011). Mais, de par sa constitution en hémocytes, un de ses rôles majeurs est de participe aux mécanismes de défense immunitaire (pour revue, Donaghy et al., 2009).
Les cellules circulantes de défense ou hémocytes baignent dans le plasma de l’hémolymphe et des fluides extrapalléaux. L’hémolymphe circule à travers l’organisme grâce au système circulatoire semi-ouve rt en contact avec les tissus. Chez les bivalves, les fluides extrapalléaux sont en contact avec le manteau et la coquille (Allam et Paillard, 1998.)
Les différents types d’hémocytes sont caractériséspar leur morphologie ou leurs composants métabolites et leur fonction. Chez la palourde japonaise, trois types de cellules hémocytaires sont recensées : les granulocytes (cellules granuleuses), les hyalinocytes (cellules agranuleuses) et les blastes (Auffret, 1988, Allam et al., 2002, Matozzo et al., 2008).
Les paramètres environnementaux influent sur la concentration en hémocytes de R. philippinarum. Soudant et al., 2004 ont montré qu’avec des températures estivales plus élevées, la concentration en hémocytes totaux (THC) était plus élevée. D’autre part, l’effet combiné d’une température élevée à 30°C à une forte salinité (38‰) affecte des répon ses fonctionnelles des hémocytes de la palourde japonaise (Munari et al., 2011).
Une augmentation des cellules de l’hémolymphe serait liée à l’alimentation et aux périodes de reproduction chez l’huître et la palourde (Ford et al., 1993, Oubella et al., 1994 ; Delaporte et al., 2003).
L’environnement cellulaire peut jouer sur la morphologie des hémocytes. En effet, un arrondissement des cellules suite à une exposition à du cuivre (Fagotti et al., 1996) ou à un contact bactérien a été démontré (Choquet et al., 2003).

Phagocytose

Le processus biologique de phagocytose permet l’élimination de petites particules telles que les virus et les bactéries. La membrane cytoplasmique de l’hémocyte englobe la particule étrangère après sareconnaissance et son adhésion. Le phagosome internalise la particule puis fusionne avec des lysosomes pour former un phagolysosome qui sera par la suite détruit par des molécules (enzymes lysosomiales et espèces réactives de l’oxygène).
Des variations dans l’activité de phagocytose ont été démontrées suite à des stress bactériens ou selon différentes conditions environnementales. Une baisse de la phagocytose est observée chez la palourde européenne Ruditapes decussatus en présence du parasite Perkinsus atlanticus (Ordas et al., 1999). Des palourdes japonaises de la côte ouest des Etats-Unis présentent une activité de phagocytose plus importante que celle des populations françaises de cette espèce (Allam et al., 2001). De plus, une baisse de la phagocytose intervient en période de reproduction chez l’huître et chez l’ormeau (Delaporte et al., 2006, Gagnaire et al., 2006, Travers et al., 2008) et après à une augmentation de la température (Hégaret et Wikfors, 2005a, 2005b).
La phagocytose du V. tapetis par les hémocytes de R. philippinarum est illustrée dans la figure 2. Fig. 2 : Processus de phagocytose de V. tapetis par les hémocytes de la palourde japonaise R. philippinarum. (Paillard, 2004)

Les réactions humorales

L’immunité humorale se traduit par l’intervention de molécules solubles à caractère cytotoxique produites par les hémocytes. Les effecteurs humoraux tels que les peptides antimicrobiens, les inhibiteurs de protéases, les enzymes lysosomales, les lectines interviennent dans la réponse hémocytaire. En effet, les hémocytes des bivalves synthétisent par exemple les lectines ayant un rôle de reconnaissance et d’agglutination de microbes tandis que les peptides antimicrobiens (defensin, mytilin, …) ont principalement une fonction bactéricide. Des peptides antimicrobiens ont été identifiés suite à des challenges bactériens chez al palourde européenne ou chez la palourde japonaise (Gestal et al., 2007 ; Zhao et al., 2010).
Les enzymes lysosomiales contenues dans l’hémolymphe émanent des hémocytes et sont d’autres facteurs intervenant dans le processus immunitaire comme la lysozyme ou la Leucine Amino Peptidase (LAP) (Oubella et al., 1994).
L’existence de mémoire immunitaire spécifique commence à être acceptée chez les invertébrés (Rowley et Powell, 2007). Chez le gastéropode Biomphalaria. glabrata, des molécules proches des immunoglobulines, les IgSF présentent une hypervariabilité génétique rappelant le système de reconnaissance des Ig des vertébrés. Une telle mémoire immunitaire n’a pas été démontrée chez la palourde japonaise. Cependant, récemment des expériences ont été menées afin de voir l’effet d’une inoculation répétée sur des paramètres hémocytaires, le développement du dépôt brun et sur la réparation. Il semble que des individus déjà exposés à la bactérie développent une réparation plus rapide (Trinkler, 2009).
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) (oxygène O, superoxyde O -, radical hydroxyl OH, peroxyde d’hydrogène H2O2) et azotées (RNS) (oxyde nitrique NO, peroxynitrite ONOO) participent à la réponse immunitaire après une stimulation des hémocytes par des agents bactériens. Ces ROS et RNS sont utiles pour la destruction des pathogènes. Elles sont composées de radicaux libres tels que le radical hydroxyl (OH), les ions peroxydes et l’oxyde nitrique NO (Fig. 3). Ces radicaux étant très réactifs peuvent également être nocifs aux cellules de l’organisme lorsqu’ils sont présents en grande quantité. Leur dégradation est contrôlée par l’intervention d’enzymes antioxydantes. Le peroxyde d’hydrogène H2O2 est généré par l’intervention de la superoxyde dismutase. La catalase dégrade le peroxyde d’hydrogène en O2 et H2O. L’ion superoxyde (O2), en présence de l’oxyde nitrique (NO) produit du peroxinitrite (ONOO).

L’oxyde nitrique

Le NO est une molécule radicalaire peu stable.
La nitrique oxyde synthase (NOS) produit l’oxyde nitrique (NO) en transformant la L-arginine en L-citrulline en présence d’oxygène (Fig. 3 et 4). Le radical NO agit avec le dioxygène pour produire du NO3- et NO2-. Ces deux composés sont mesurables par différentes méthodes spectrométriques comme celle de la réaction de Griess (cf chapitre 2 : matériels et méthodes).
La synthèse du NO est induite par la stimulation des hémocytes en présence de particules microbiennes. La molécule de NO est toxique pour les agents pathogènes mais à une certaine concentration, elle devient toxique pour les cellules de l’hôte. Produite par induction par les hémocytes, le NO a pour rôle de détruire les bactéries empêchant leur multiplication.
Des productions de NO engendrées par des agents pathogènes ou des substances bactériennes ont été estimées chez la moule de Méditerranée Mytilus galloprovincialis, chez l’huître américaine (Villamilet al., 2007), chez la palourde européenne R. decussatus (Novas et al., 2007 ; Taffala et al., 2003, Mar Costa et al , 2008). Par contre, aucune mesure sur la production de NO chez R. philippinarum n’a encore été faite.
Chez les vertébrés, il existe trois formes de Oxyde Nirique Synthase (NOS) :
1) nNOS ou NOS I forme retrouvée dans les cellules nerveuses, 2)iNOS ou NOS II forme inductible de l’enzyme et 3) eNOS ou NOS III forme retrouvée principalement dans les cellules endothéliales. Mais, chez les invertébrés, la NOS correspond davantage à la forme inductible. Certains auteurs ont montré l’existence d’un pattern d’expression constitutive et inductible de la NOS (Imamura et al., 2002).

La phénoloxydase

L’activation de la prophénoloxydase (ProPO) est une mécanisme de défense immunitaire chez les invertébrés contre les infections microbiennes (Soderhall et Cerenius, 1998). La cascade de la réaction de la prophénoloxydase en phénoloxydase est stimulée par la présence de peptidoglycane, lipopolyssacharides et de 1-3 B-glucanes (pour revue Cerenius et Soderhall, 2004) (Fig. 5).
Des réactions en cascade par des sérines protéasesendogènes permettent le clivage de la ProPO en PO active. La phénoloxydase (PO) catalyse des quinones précurseurs de la mélanine (Soderhall et al., 1994, Kan et al., 2008). Les quinones participent à la défense contre des microorganismes comme les radicaux hydroxyles. Néanmoins, en quantités excessives, les quinones et la mélanine peuvent devenir dangereux pour l’hôte les synthétisant (Kan et al., 2008). La mélanine est un composé bactéricide permettant l’encapsulation de corps étrangers.
Fig. 5: Système de l’activation de la prophénol-oxydase des arthropodes et réactions en chaîne menant à la synthèse de mélanine (d’après Cer nius et Soderhall, 2004).
Plusieurs études concernent l’activité de la PO chez des invertébrés marins. Munoz et ses collaborateurs (2006) ont montré une activité de la PO des palourdes européennes plus forte pour une infestation faible du parasite Perkinsus sp par rapport à une infestation élevée. La présence du Bonamia sp semble diminuer l’activité de la PO de O. edulis (Cochennec-Laureau et al., 2003, da Silva et al., 2008). Très récemment, Luna-Acosta et ses collaborateurs (2011) ont démontré que l’activité antimicrobienne chez l’huître C. gigas induit les réactions des phénoloxydases et en particulier celle de la laccase.
Un suivi de la PO sur 6 mois a été réalisé sur despopulations de palourdes japonaises en effectuant des ponctions d’hémolymphes répétées. Les valeurs les plus fortes sont mesurées lors de la première ponction (Ford et Paillard, 2007). Des animaux présentant au départ du suivi des fortes activités PO sont significativement moins sujets à développer la maladie (Paillard, Comm pers). De plus, cette espèce développe une couche de conchyoline mélanisée lorsqu’elle est atteinte par la maladie de l’anneau brun. Une relation entre l’activité de la PO et le développement du symptôme de la maladie est suggérée. Une activité de PO plus élevée a été miseen évidence sur des huîtresS. glomerata résistantes à la maladie QX (Newton et al., 2004).
D’autre part, les périodes de reproduction et sont mises en cause dans les variations de l’activité PO (Travers et al., 2008). Chez l’ormeau Haliotis tuberculata, l’activité PO est plus faible après la période deponte.

Table des matières

Introduction générale
Chapitre 1: Introduction bibliographique
1- Maladies infectieuses des invertébrés marins
2- Susceptibilité et résistance aux maladies infectieuses
2-1-Qu’est ce qu’un individu résistant ?
2-2-Sélection d’animaux résistants par amélioration génétique
3- Biomarqueurs pour la sélection d’animaux résistants
3-1-Hémocytes
3-1-1-La phagocytose
3-1-2-Les réactions humorales
3-1-2-1-L’Oxyde nitrique
3-1-2-2-L’actvité phénol-oxydase
3-1-3-La capacité d’adhérence
3-2-Outils génétiques
3-2-1-Les microsatellites
3-2-2-Les banques soustractives
4- Modèle biologique : Ruditapes philippinarum
4-1- Classification taxonomique
4-2- Aire de répartition mondiale
4-3- Biologie
4-3-1-Anatomie
4-3-2-Reproduction et cycle de vie
4-4-Production
4-4-1 Productions mondiale et française
4-4-2 Production en milieu contrôlé
4-5-Maladie de l’Anneau Brun (MAB)
4-5-1-L’agent pathogène de la maladie
4-5-2-Colonisation de la bactérie et formation de l’anneau brun
4-5-3-Physiologie de la palourde face à la MAB
4-5-4-Moyens de défense chez R. philippinarum
4-5-5 Signe de résistance à la MAB 55
Chapitre 2 : Matériel et méthodes
1- Sélection des géniteurs
1-1- Provenance des sites de cultures
1-2- Lot de production des géniteurs
2- Juvéniles de la première génération
2-1- Pontes et stades larvaires
2-2- Semis sur trois sites
3- Mesures de la taille des animaux
4- Diagnostic du développement du dépôt de conchioline et de la réparation coquillière
5- Inoculation par solution bactérienne
5-1-Suspension de Vibrio tapetis
5-2- Inoculation
6- Mesures des paramètres hémocytaires
6-1- Concentration hémocytaire totale (THC) et viabilité
6-2- Test d’adhérence couplé au dosage de l’oxyde nitrique
6-2-1- Mesure de l’adhérence
6I-2-2- Dosage de l’oxyde nitrique
6-3- Activité de phagocytose
6-4- Mesures des Espèces Réactives de l’Oxygène (ROS)
6-5- Dosage des protéines
6-6- Activité Phénol-Oxydase (PO)
7- Détermination des génotypes des microsatellites
7-1- Extraction de l’ADN
7-2- Amplification : PCR
7-3- Electrophorèse
8- Hybridation Soustractive Suppressive (SSH)
9- Mesure de la transcription de gènes
10- Analyses statistiques
Chapitre 3 : Induction de l’Oxyde Nitrique (NO) par les hémocytes de la palourde japonaise, Ruditapes philippinarum, après un contact in vitro avec Vibrio tapetis
1- Introduction
2- Article 1 : Involvement of Nitric Oxide in the in vitro interaction between Manila clam, Ruditapes philippinarum hemocytes and the bacterium Vibrio tapetis
Chapitre 4: Sélection des géniteurs
1- Sélection des géniteurs de Landéda suite à une incubation bactérienne (Janvier 2008)
1-1 Incubation après inoculation par Vibrio tapetis et Diagnostic de la MAB
1-2 Evolution des géniteurs sélectionnés
2- Sélection des géniteurs de Chausey (août 2008)
2-1 Paramètres hémocytaires pour les lots R et S 90
2-2 Corrélations entre paramètres hémocytaires
2-3 Analyses multivariées des paramètres sur les deux lots de Chausey 93
3- Sélection de géniteurs par analyses de paramètres hémocytaires sur des géniteurs de Landéda (avril 2009)
3-1 Résultats généraux
3-2 Résultats par jour de prélèvement d’hémolymphe
4- Effet du prélèvement de l’hémolymphe sur le développement de la MAB de l’Ile Tudy
4-1- Schéma expérimental
4-2- Etat physiologique hémocytaire de base des animaux
4-3- Influence du prélèvement sur la MAB
4-3-1- Paramètres hémocytaires
4-3-2- Développement de la maladie et réparation coquillère
4-3-3- Cas du NO
5- Discussion générale
Chapitre 5 : Détermination de la parenté par un outil génétique et par un caractère phénotypique de la coquille
1-Détermination de la parenté par un outil génétique : microsatellite
1-1 Analyses microsatellites des deux populations : Lot PJ-06-07 et Lot PJ-06-10
1-2 Croisements effectués
1-3 Génotypes des parents
1-4 Apparentement
2- Détermination de la parenté par un caractère phénotypique de la coquille
Article 2: Shell color and shell pattern as a complementary tool of microsatellites for Ruditapes philippinarum family identification in field experiments
Chapitre 6 : Comparaison des performances physiologiques des familles en « common gardens » et au laboratoire
1-Tests préliminaires sur les larves de palourdes : effet de V. tapetis
2- Suivi en common garden
2-1 Températures des sites
2-2 Répartition des familles dans les deux lots PJ-08-R1 et PJ-08-R2
2-3 Croissance des coquilles
2-4 Prévalence de la MAB
3- Paramètres hémocytaires sur des juvéniles de l’lle Tudy en Juin 2009
3-1 Concentration et viabilité hémocytaire
3-2 Capacité d’adhérence
3-3 Concentration en NO
4- Comparaison du développement de la MAB et de la réparation de la coquille (Rab) sur les familles des trois sites suite à l’inoculation du V. tapetis
4-1 Concentration et viabilité hémocytaire
4-2 Capacité d’adhérence
4-2-1 Animaux témoins
4-2-2 Animaux inoculés
4-3 Concentration en NO
4-3-1 Animaux témoins
4-3-2 Animaux inoculés
4-4 Prévalence de la MAB et réparation coquillière
4-5 Expression de transcrits de gènes
Chapitre 7 : Identification d’ESTs d’intérêt suite à une infection in vivo de palourdes japonaises Ruditapes philippinarum, par la bactérie Vibrio tapetis et expression différentielle au niveau du manteau et des hémocytes
1- Introduction
2- Article 3: Identification of genes that are differentially expressed in Ruditapes philippinarum mantle through a Vibrio tapetis incubation
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques
Annexes
Analyse génétiques sur les palourdes des lots R et S
Communications scientifiques

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