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Fabrication du moule

Le wafer est d’abord nettoyé avec un traitement de surface par plasma O2 (5 min, 80 W), puis déshydraté dans un four (15 min, 100°C). Une couche de hexamethyldisilazane est déposée sur le wafer afin de favoriser l’adhérence de la résine sur le wafer. La couche de résine positive est déposée par « spin coating » (durée 30 s, vitesse 3600 rpm, accélération 5000 rpm/s, épaisseur 1.1 µm). Le wafer est ensuite exposé aux UV (20 mW/cm2@ 405nm, durée 11s, le masque est collé au wafer par aspiration) à travers un masque contenant les motifs correspondant aux piliers, voir étape 1 de la figure 4. La résine est chauffée (60s, 110°C) puis développée à l’aide d’un solvant (MF CD 26), voir étape 2 de la figure 4. Enfin, les micromotifs sont transférés sur le wafer à l’aide d’une gravure ionique réactive profonde (AlCATEL-AMS 400, 243s). Cette gravure est constituée d’une étape de gravure du Si par SF6 (2s) et d’une étape de passivation des surfaces par C4F8 (3.5s). Ces deux étapes sont répétées en boucle pour avoir une gravure anisotrope (uniquement dans la direction z). La résine restante est délaquée par plasma O2 (5 min, 80 W), voir étape 3 de la figure 4.
La même séquence d’étapes (dépôt de la résine positive sur le wafer, exposition de la résine aux UV à travers un masque contenant cette fois le motif des réservoirs et des canaux, développement de la résine, gravure, délaquage) est réalisée pour créer les canaux et les réservoirs. À noter que l’alignement des canaux sur les motifs de piliers déjà existants sur le wafer est effectué manuellement sous contrôle optique. Cette étape est réalisée avec un aligneur optique (Suss Microtec, MA 150) qui permet un alignement au micron près. Le temps de gravure ionique pour structurer les canaux est augmenté à 251s
avec les mêmes séquences de gravure que pour les piliers. Pour pouvoir démouler le PDMS, la surface de ce dernier est passivée à l’aide d’un dépôt de perfluorodecyltrichlorosilane réalisé en phase vapeur.
La première génération de moule a été fabriquée avec une seule étape de gravure. Pour une hauteur de 10 µm des canaux, la hauteur des piliers est de 4 µm. Les trous de diamètre 2 µm ont été moins gravés que les zones intercanaux qui font des centaines de micromètres carrés. Pour éviter ce problème, les trous pour les piliers et les zones intercanaux doivent être gravés les uns après les autres avec différent temps de gravure. Pour ce faire, deux étapes de photolithographies sont réalisées. Les trous pour les piliers ont été créés lors de la première étape et les micros canaux lors de la deuxième étape
Le moule fabriqué en salle blanche est utilisé pour fabriquer les puces micros fluidiques en PDMS. La succession d’étapes pour créer ces dispositifs est présentée dans la figure 5. Le prépolymère de silicone est mélangé avec un agent de réticulation avec un ratio de 10 g pour 1 g, puis coulé sur le moule. Pour éliminer les bulles créées lors du mélange du polymère, l’ensemble est placé dans une cloche sous vide pendant quelques minutes. La réticulation du PDMS, étape 1 de la figure 5, est obtenue en plaçant le wafer dans un four (100°C) pendant 1 heure puis démoulé dans l’éthanol, étape 2 de la figure 5, et laissé sécher à l’air libre, étape 3 de la figure 5. Cette étape est critique, en effet, si le PDMS est démoulé à l’air libre, les piliers s’effondrent complètement dans des directions aléatoires. Démouler dans l’éthanol permet de garder les piliers droits. Le dispositif est ensuite placé sur une lamelle de verre, avec les motifs vers la lamelle de verre. Lors du séchage à température ambiante, le ménisque de l’éthanol qui se déplace au fur et à mesure de l’évaporation dans le canal, va courber les piliers toujours de la même manière. Les piliers se courbent jusqu’à toucher le flanc du canal. L’ouverture des réservoirs
à l’aide d’un emporte-pièce permet de relever les piliers. Ce phénomène est certainement dû au
déséquilibre de pression créé dans les canaux lors de l’ouverture. À noter que cet effet de redressement ne fonctionne pas systématiquement (dans 50 % des cas environ pour les canaux de 12 µm de large et dans 10% des cas environ pour les canaux de 6 µm de large). Dans les cas où le redressement complet échoue, quelques fois, aucun pilier ne se relève, parfois seulement la moitié et parfois l’on peut voir tous les piliers de 4 canaux de 12 µm de large relevés, à l’exception d’un seul. Malgré ce taux d’insuccès, comme un moule complet possède au total 22 dispositifs, il est possible d’obtenir en moyenne 12 dispositifs utilisables à chaque moulage. Une fois séchés, les dispositifs sont retournés et exposés à un plasma O2 (90 s, 50 W) pour activer leurs surfaces. Les lamelles de verre sont aussi exposées au plasma O2. Pour finir, les dispositifs en PDMS sont collés sur les lamelles de verre de façon irréversible, étape 5 de la figure 5.
Une fois collés, les dispositifs sont placés 1 heure à 100°C dans un four pour être stérilisés, puis stockés dans une solution stérile (PBS) pour que les canaux restent hydrophiles. Pour les expériences, un traitement de surface est réalisé pour promouvoir (fibronectine) ou inhiber (PEG-g-PLL) l’adhérence des cellules, étape 6 de la figure 5. Les cellules sont ensuite injectées dans les réservoirs et immergées dans le milieu de culture, étape 7 de la figure 5.
Caractérisation des dimensions
La Figure 6 montre l’ensemble des canaux liés aux réservoirs, sur la figure 6A pour les canaux de 12 µm et sur la figure 6B pour les canaux de 6 µm de large. Une vue agrandie de l’un des canaux permet de visualiser les piliers intégrés au centre des canaux, puis une image centrée sur un pilier, permet d’observer la forme et l’état de surface des piliers. On peut notamment observer des lignes régulières creusées le long des canaux et à la périphérie des piliers qui proviennent des cycles de gravure/passivation décrits précédemment.
Les dimensions des canaux et des piliers de la troisième génération ont été mesurées par microscopie électronique à balayage après une calibration soigneuse de l’instrument. La hauteur du canal hc, la hauteur des piliers hp, le diamètre des piliers dp et la largeur du canal W sont donnés dans le tableau ci-dessous.

Table des matières

Introduction Générale
Chapitre 1 : Contexte & État de l’art
1.1. Les macrophages et leur environnement
1.1.1. Rôle immunitaire des macrophages
1.1.2. Activation des macrophages
1.1.3. Rôle du microenvironnement
1.1.4. Contextes pathologiques
1.2. Propriétés mécaniques des macrophages
1.2.1. Les structures d’adhérences des macrophages : Podosomes
1.2.2. Perception et transduction des stimuli mécaniques au sein de la cellule
1.3. Migration des macrophages
1.3.1. Mode mésenchymateux & amiboïde
1.3.2. Un continuum de mode de migration
1.3.3. Rôle du noyau
1.3.4. Forces appliquées pendant la migration
1.4. Mesure de forces cellulaires
1.4.1. Panorama des techniques expérimentales actives
1.4.2. Panorama des techniques expérimentales passives
1.5. Objectifs de la thèse
Table des illustrations
Chapitre 2 : Micro canaux équipés de capteurs de forces pour l’étude de la migration des macrophages en milieu confiné
2.1. Fabrication de canaux équipés de micropiliers en PDMS
2.1.1. Design des dispositifs
2.1.2. Fabrication du moule
2.1.3. Réplique du moule en PDMS
2.2. Caractérisation du dispositif et modélisation des capteurs de force
2.2.1. Caractérisation des dimensions
2.2.2. Évaluation des propriétés mécaniques des piliers de PDMS
2.3. Analyse de la flexion des piliers due aux forces mécaniques des macrophages en migration confinée
2.3.1. Acquisition des images
2.3.2. Recalage des images
2.3.3. Segmentation des images de fluorescence
2.3.4. Suivi des piliers
2.3.5. Classification des piliers
2.3.6. Recalage des piliers
2.3.7. Zone nucléaire et extra nucléaire
2.3.8. Evaluation de l’orientation et de l’amplitude des forces
2.3.9. Limitation de détection
2.4. Résultats : Migration des macrophages dans les canaux équipés de piliers
2.4.1. Mise en place de l’expérience
2.4.2. Observation de la migration des macrophages dans les canaux équipés ou non de piliers.
2.4.3. Observation des macrophages fixés dans les canaux au microscope électronique à balayage.
2.4.4 Observation des macrophages par immunofluorescence en 3D
2.4.5. Les noyaux des macrophages
2.5. Résultats : Forces appliquées par les macrophages pour fléchir les piliers
2.5.1. Amplitude de la flexion
2.5.2. Orientation des forces
2.6. Conclusion et discussion
Table des illustrations
Chapitre 3 : Treillis tridimensionnels pour l’étude de la migration des macrophages en 3D
3.1. Fabrication des treillis par lithographie optique à deux photons
3.1.1. Design du réseau 3D
3.1.2. Fabrication de réseaux en résine par lithographie laser biphotons
3.2. Caractérisation du réseau 3D
3.2.1. Mesure dimensionnelles des structures
3.2.2 Propriétés mécaniques de la résine et du réseau
3.3. Analyse des déformations des poutres du réseau 3D par les macrophages
3.3.1. Traitement d’images appliqué aux vidéos pour l’analyse des déformations : Déformées
poutres & suivi des noeuds du réseau
3.3.2. Déformées de la maille
3.4. Observation et caractérisation de la migration 3D au sein du réseau Tridimensionnel
3.4.1. Invasion de l’échafaudage par les cellules
3.4.2. Déformation du réseau par un macrophage
3.4.3. Evaluation des forces cellulaires dans le contexte 3D
3.5. Conclusion
Table des illustrations
Conclusion générale

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