Mise en place d’une méthode ciblée pour l’analyse des toxines hydrophiles

Matériels et Méthodes

Produits chimiques et réactifs

Toutes les solutions ont été préparées avec des produits chimiques de qualité analytique et de l’eau ultra pure (18,2 M.cm) produite par avec un système de purification d’eau Milli-Q Academic (Millipore S.A., Saint-Quentin en Yvelines, France). L’acide chlorhydrique (HCl ; 37%) et l’hydroxyde de sodium (NaOH ; 99%) ont été achetés auprès de Merck (Fontenaysous-Bois, France). Le formiate d’ammonium (> 97%) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, France). L’acide formique (98-100%), l’acétonitrile (ACN ; qualité LC-MS) et le méthanol (MeOH ; qualité LC-MS), l’acide acétique glacial (qualité HPLC) ont été achetés auprès de Fisher Scientific SAS (Illkirch, France). La solution d’hydroxyde d’ammonium (25%) provient de chez VWR (Fontenay-sous-Bois, France). Les solutions de calibrations d’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) pour l’analyse par LCHRMS ont été achetées auprès de Sciex (Nieuwerkerk aan den Ijssel, Pays-Bas). Les cartouches SPE Supelclean ENVI-Carb 250 mg/3 mL ont été commandées chez (Sigma-Aldrich, France). I.2. Solutions étalons Les solutions étalons certifiées de saxitoxines proviennent du Conseil national de recherches du Canada (CNRC, Halifax, Nouvelle-Écosse, Canada). La solution étalon de la tétrodotoxine a été commandée chez CIFGA (Espagne) (Tableau 13).

Préparation des solutions de travail

o Solutions étalons Une solution multitoxines a d’abord été préparée à partir des solutions étalons disponibles dans le laboratoire. Un volume de 100 µL a été prélevé de chacune des solutions étalons et mélangé dans un vial de 1,5 mL. À partir de cette solution qu’on appellera « solution stock » des solutions à différents niveaux de concentration ont été préparées par dilution (Tableau 14). Ces solutions filles ont été injectées pour tracer les gammes d’étalonnage en solvant et en matrice.

o Phases mobiles

Les phases mobiles doivent être préparées avec précaution en respectant parfaitement les volumes d’additifs ajoutés à chaque phase. Les solutions doivent être bien mélangées avant utilisation et conservées à température ambiante. Phase A1 : 500 mL d’eau MilliQ + 75 μL d’aide formique + 300 μL d’hydroxyde d’ammonium. Conservée 24h. Phase B1 : 700 mL d’acétonitrile (LC-MS) + 300 mL d’eau MilliQ (LC-MS) + 100 μL d’acide formique. Conservée 3 mois. Phase A2 : 200 mL d’eau MilliQ + 1 mL d’acide formique. Conservée 1 semaine. Phase B2 : 100% méthanol (LC-MS). Conservée 3 mois. o Solutions utilisées pour la préparation d’échantillons S1 : solvant d’extraction (1% HAc) : 1000 mL d’eau MilliQ + 10 mL d’acide acétique (HAc). S2 : « extract modifier » : solution d’hydroxyde d’ammonium à 25%. S3 : solution acide de conditionnement et élution SPE (20% d’acétonitrile avec 1% HAc) : 200 mL d’acétonitrile (HPLC) + 800 mL d’eau Milli-Q + 10 mL HAc. S4 : solution basique de conditionnement SPE (0,025% NH3) : 500 mL d’eau Milli-Q + 500 μL de la solution à 25% d’hydroxyde d’ammonium. S5 : solvant d’élution (80% ACN avec 0,25% HAc) : 80 mL d’acétonitrile + 20 mL d’eau MilliQ + 250 μL d’acide acétique.