Régulation de l’expression des gènes du système d’oxydation phosphorylante 

La mitochondrie 

Structure : Les mitochondries sont des organelles cytoplasmiques ovoïdes d’une longueur d’environ 1 à 2 µm. Leur nombre est variable en fonction du type cellulaire, de quelques dizaines à quelques milliers, et le compartiment mitochondrial peut occuper jusqu’à 20 % de l’espace cellulaire. La morphologie et la localisation intracellulaire diffèrent également selon les tissus. Leur demi-vie est de l’ordre de 6 à 10 jours suivant les cellules. Ces organelles présentent plusieurs compartiments délimités par deux membranes :
la membrane externe, perméable à de nombreuses molécules de faible masse moléculaire, l’espace intermembranaire, la membrane interne qui constitue une barrière sélective, y compris pour les petites molécules.
Elle s’invagine, formant les crêtes mitochondriales dont le nombre et l’organisation varient en fonction du type cellulaire. Les différents complexes protéiques réalisant la phosphorylation oxydative sont localisés au niveau de la membrane interne,
la matrice mitochondriale limitée par la membrane interne est le siège de nombreuses voies métaboliques comme le cycle de Krebs et la ß-oxydation des acides gras. Elle contient plusieurs copies de l’ADN mitochondrial ainsi que les éléments nécessaires à sa réplication et à son expression.

Métabolisme énergétique

La mitochondrie peut être définie comme la centrale énergétique de la cellule. Elle est, en effet, le siège des voies métaboliques terminales de dégradation des molécules énergétiques (ß-oxydation des acides gras, cycle de Krebs) et de la phosphorylation oxydative. La mitochondrie produit ainsi l’essentiel de l’ATP cellulaire qui est le principal intermédiaire donneur d’énergie libre dans les systèmes biologiques. Le taux de renouvellement de l’ATP est très important et les besoins quotidiens pour un homme adulte sont estimés à 70 kg.

La ß-oxydation : Les acides gras sont stockés dans le tissu adipeux sous forme de triglycérides. Ils sont libérés par l’action de lipases puis activés en acyl-coenzyme A (acyl-CoA) par l’acyl-CoA synthétase, en présence d’ATP et de coenzyme A. Les acides gras activés doivent ensuite pénétrer dans la matrice mitochondriale pour y être dégradés. Ce transport se fait par simple diffusion pour les acides gras à chaîne courte ou moyenne. Pour les acides gras à longue chaîne, un mécanisme de transport spécifique est nécessaire : à la face externe de la membrane mitochondriale interne, le groupement acyle est condensé avec la carnitine par la carnitine palmitoyl transférase I. Une translocase transporte ensuite l’acyl-carnitine dans la matrice en échange d’une carnitine libre.
La carnitine palmitoyl transférase II, localisée au niveau de la face matricielle de la membrane interne, catalyse la transformation de l’acyl-carnitine en acyl-CoA.

Dans la matrice mitochondriale, les acyl-CoA sont dégradés par un cycle récurrent de 4 réactions: la ß-oxydation. La première étape est une oxydation liée au FAD (flavine adénine dinucléotide). Les trois réactions suivantes correspondent à une hydratation, une oxydation liée au NAD+ (nicotinamide adénine dinucléotide) et une réaction de thiolyse par le groupe thiol d’une molécule de coenzyme A. Cette dernière réaction, catalysée par la ß-cétothiolase, libère une molécule d’acétyl-CoA et un acyl-CoA amputé de 2 atomes de carbone. A chaque cycle, la chaîne est ainsi réduite de 2 carbones produisant de l’acétyl-CoA qui entre dans le cycle de Krebs ainsi que 2 coenzymes réduits NADH et FADH2.

Le cycle de Krebs : Le cycle de Krebs, également appelé cycle de l’acide citrique ou cycle des acides tricarboxyliques, est la voie terminale commune d’oxydation des molécules énergétiques : aminoacides, acides gras et glucides. La plupart des molécules énergétiques entrent dans le cycle sous forme d’acétyl-CoA. Le pyruvate provenant de la glycolyse est transformé en acétyl-CoA par une réaction de décarboxylation oxydative catalysée par un gros complexe multienzymatique, la pyruvate déshydrogénase. Cette réaction s’effectue dans la matrice mitochondriale. Les acides gras sont dégradés en acétyl-CoA par la ß-oxydation. Les atomes de carbone des différents aminoacides sont transformés en pyruvate, en acétyl-CoA ou en intermédiaires du cycle de Krebs.
Les étapes d’oxydation du cycle de Krebs produisent des équivalents réducteurs qui sont acceptés par le NAD et le FAD. Chaque cycle produit ainsi 3 NADH et un FADH2.

Les coenzymes réduits, NADH et FADH2, produits par la ß-oxydation et le cycle de Krebs transfèrent ensuite leurs équivalents réducteurs à la chaîne respiratoire mitochondriale. Il est à noter que le pouvoir réducteur du NADH formé lors de la glycolyse est transféré dans la mitochondrie par un système de navettes : navette du glycérol 3-phosphate et navette malate-aspartate.

Chaîne respiratoire et stress oxydant 

La mitochondrie est une des sources majeures d’espèces oxygénées réactives (EORs) dans la cellule. Le principal site de production est la chaîne respiratoire au niveau des complexes I et III, et dans une moindre mesure au niveau du complexe II. Ce phénomène est lié à l’échappement d’électrons de la chaîne respiratoire qui vont réagir avec l’oxygène pour former un anion superoxyde (O2–). L’anion superoxyde peut ensuite être transformé en peroxyde d’hydrogène (H2O2) et en radical hydroxyl (OH.). D’autres sites de production moins importants ont également été identifiés dans la mitochondrie : glycérol-1-phosphate déshydrogénase et dihydroorotate déshydrogénase.

Les EORs libérées dans l’espace intermembranaire et dans la matrice mitochondriale sont des molécules toxiques. L’anion superoxyde est capable d’inactiver des enzymes contenant des centres Fe-S comme le complexe I ou l’aconitase. Le peroxyde d’hydrogène est relativement stable mais en présence de fer ferreux (Fe2+), il peut être transformé en radical hydroxyl par la réaction de Fenton. Cette espèce radicalaire extrêmement réactive attaque les protéines, les lipides insaturés (formant des peroxydes) et les acides nucléiques.

Plusieurs systèmes antioxydants permettant à la mitochondrie de lutter contre cette production continue d’EORs ont été identifiés. La superoxyde dismutase à manganèse (MnSOD), présente dans la matrice mitochondriale, est connue depuis longtemps. Cette enzyme catalyse la transformation de l’anion superoxyde en peroxyde d’hydrogène. Le peroxyde est ensuite détruit par différents systèmes dont l’importance biologique respective n’est pas encore bien déterminée. Un premier système est constitué par la peroxyrédoxine 3, la thiorédoxine mitochondriale et la thiorédoxine réductase mitochondriale . Une autre protéine mitochondriale capable de détruire le peroxyde d’hydrogène est la phospholipide hydroperoxyde glutathion peroxydase . Cette enzyme peut également réduire les phospholipides peroxydés dans les membranes. Une autre glutathion peroxydase, dite classique, a également été décrite dans la mitochondrie mais elle serait présente en très petite quantité. Enfin, l’isocitrate déshydrogénase NADP-dépendante mitochondriale jouerait un rôle important dans la lutte contre le stress oxydant en étant une source majeure de NADPH, un équivalent réducteur nécessaire à la régénération des formes réduites du glutathion et de la thiorédoxine.

Différents processus physiopathologiques ont été associés à la production d’EORs par la chaîne respiratoire. Tout d’abord, il a été montré que des dysfonctionnements du complexe I entraînent une augmentation de la production d’EORs et une induction de la MnSOD. Ce phénomène jouerait un rôle important dans la pathogénicité des déficits du complexe I en induisant un important stress oxydant via la production de radical hydroxyl. D’autre part, la mitochondrie aurait un rôle clé dans la pathogénicité de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique ou l’ataxie de Friedreich, notamment par l’intermédiaire de dommages oxydatifs . Le rôle majeur du stress oxydant mitochondrial évoqué dans le phénomène d’apoptose pourrait expliquer ce lien . Enfin, l’accumulation de dommages liés aux EORs produites dans la mitochondrie, en particulier au niveau de l’ADN mitochondrial, pourrait jouer un rôle important dans le vieillissement.

Le génome mitochondrial 

Organisation : La mitochondrie possède son propre génome sous forme d’un ADN bicaténaire et circulaire. L’ADN mitochondrial représente environ 1 % de l’ADN cellulaire total (environ 1 000 à 10 000 copies par cellule). Le nombre de copies par mitochondrie varie de 5 à 10.
Chez l’homme, cet ADN est composé de 16 569 paires de bases (pb) et ne comporte pas d’introns. Sa séquence est entièrement connue . Les deux brins peuvent être séparés physiquement en un brin lourd (H) riche en bases puriques (G et A) et un brin léger (L) riche en bases pyrimidiques (C et T).

L’ADN mitochondrial contient 37 gènes qui codent pour 13 protéines, 22 ARN de transfert et les ARN ribosomaux 12S et 16S. Toutes les protéines codées sont des sous-unités de complexes enzymatiques du système de la phosphorylation oxydative. Les 2 ARN ribosomaux, les 12 protéines et les 14 ARN de transfert (ARNt) sont codés par le brin lourd. Le brin léger code quant à lui 8 ARN de transfert et une protéine. Seules 2 régions de l’ADN mitochondrial ne sont pas codantes : une séquence de 1122 paires de bases (pb), appelée D-Loop, qui contient l’origine de réplication du brin lourd et les promoteurs des brins lourds et légers, ainsi qu’une séquence de 30 pb contenant l’origine de réplication du brin léger. du génome nucléaire. Plusieurs éléments peuvent expliquer cette caractéristique : un système de réparation de l’ADN moins efficace que dans le noyau et l’absence de protection par des protéines de type histone. D’autre part, la proximité de la chaîne respiratoire qui génère des quantités importantes d’espèces oxygénées réactives, expose le génome mitochondrial à des dommages oxydatifs. Ce risque est d’autant plus important que lors de la réplication car l’ADN mitochondrial reste longtemps exposé sous forme simple brin , ce qui le rend particulièrement sensible aux attaques radicalaires.

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Réplication de l’ADN mitochondrial 

Modèle de réplication asynchrone et asymétrique : Les deux brins H et L de l’ADN mitochondrial sont répliqués de manière asynchrone et asymétrique à partir de deux origines de réplication distinctes OH et OL.
La réplication fait intervenir une ADN g-polymérase spécifique de la mitochondrie. Cette enzyme est un hétérodimère constitué d’une sous-unité catalytique a (140 kDa) et d’une sous-unité ß (55 kDa) qui se lie à l’ADN, augmentant l’affinité de l’enzyme pour l’ADN et sa processivité. La sous-unité a possède de plus une activité 3’-5’ exonucléase.

La réplication est initiée par la synthèse du brin lourd. La première étape est la production d’une amorce ARN par transcription du brin léger. Cette opération est sous le contrôle du facteur de transcription mitochondrial mtTFA. L’amorce ribonucléotidique forme un hybride ARN/ADN stable, appelé R-Loop, au niveau des régions CSBI à III (Conserved Sequence Box) localisées dans la D-Loop . L’amorce ARN est clivée en aval de CSBI par une ribonucléoprotéine, la RNase MRP (Mitochondrial RNA Processing). L’ADN g-polymérase prend alors le relais pour synthétiser le néobrin H.

L’élongation du brin H néosynthétisé crée une boucle de déplacement au niveau de laquelle le brin lourd est sous forme simple brin. Lorsque cette boucle arrive au niveau de l’origine de réplication OL, celle-ci adopte une conformation en épingle à cheveux reconnue par une ADN primase qui synthétise une amorce ARN. La boucle est riche en nucléotides T et la transition ARN/ADN se fait au niveau d’une séquence riche en GC à la base de l’épingle. Chez les vertébrés, l’élongation de la majorité des brins H néosynthétisés s’arrête rapidement au niveau de séquences de 15 nucléotides appelées séquences TAS (Termination Associated Sequence), formant une structure ADN triple brins à l’origine de la D-Loop. Chez l’homme, il n’existe qu’une séquence TAS (figure 4). Le brin H tronqué, appelé ADN 7S, a une demi-vie de 1 à 3 heures. Le mécanisme contrôlant cet arrêt de l’élongation du brin lourd n’est pas élucidé. Il permettrait de réguler le nombre de copies de l’ADN mitochondrial.

Les structures d’ADN simple brin générées lors de la réplication sont stabilisées par la protéine mtSSB (mitochondrial Single Strand Binding Protein) qui fixe l’ADN sous forme d’un tétramère. Enfin, différentes enzymes participant à la réplication de l’ADN mitochondrial ont été identifiées : une hélicase, des topoisomérases de type I et II, une ADN ligase III.

Protéome mitochondrial 

Le nombre de protéines mitochondriales est évalué à un millier, soit environ 10 % du protéome cellulaire total. Parmi ces protéines mitochondriales, la moitié seulement est référencée dans les bases de données.
Le génome mitochondrial code pour 13 protéines qui sont toutes des sous-unités de complexes enzymatiques du système de la phosphorylation oxydative. Toutes les autres protéines sont codées par le génome nucléaire puis importées dans la mitochondrie. Ce sont notamment : les autres composants du système de la phosphorylation oxydative, les protéines impliquées dans la réplication, la transcription et la traduction de l’ADN mitochondrial, les protéines des diverses voies métaboliques mitochondriales (cycle de Krebs, complexe de la pyruvate déshydrogénase, ß-oxydation des acides gras, synthèse de l’hème, synthèse des protéines fer-soufre (Fe-S)…) des protéines de lutte contre le stress oxydant, des protéines impliquées dans l’apoptose, divers transporteurs membranaires.

Table des matières

1. La mitochondrie 
1.1. Structure 
1.2. Métabolisme énergétique 
1.2.1. La ß-oxydation
1.2.2. Le cycle de Krebs
1.2.3. La phosphorylation oxydative
1.2.4. Chaîne respiratoire et stress oxydant
1.3. Le génome mitochondrial 
1.3.1. Organisation
1.3.2. Particularités génétiques
1.3.2.1. Transmission maternelle
1.3.2.2. Hétéroplasmie, effet de seuil
1.3.2.3. Ségrégation mitotique
1.3.3. Réplication de l’ADN mitochondrial
1.3.3.1. Modèle de réplication asynchrone et asymétrique
1.3.3.2. Modèle de réplication synchrone
1.3.3.3. Contrôle du nombre de copies
1.3.4. Transcription de l’ADN mitochondrial
1.4. Protéome mitochondrial 
1.4.1. Synthèse protéique mitochondriale
1.4.2. Protéines mitochondriales d’origine nucléaire
1.4.2.1. Séquence d’adressage
1.4.2.2. Protéines cytosoliques
1.4.2.3. Import à travers la membrane externe
1.4.2.4. Import au travers de la membrane interne
2. Le complexe I 
2.1. Les sous-unités 
2.2. Fractionnement 
2.3. Structure tridimensionnelle 
2.4. Cofacteurs 
2.4.1. NADH
2.4.2. FMN
2.4.3. Centres Fe-S
2.4.4. Quinones
2.5. La sous-unité 23 kDa (TYKY) 
2.6. La sous-unité 20 kDa (PSST) 
3. Régulation de l’expression des gènes du système d’oxydation phosphorylante 
3.1. Régulation transcriptionnelle 
3.1.1. Facteurs de transcription nucléaires
3.1.1.1. NRF-1
3.1.1.2. NRF-2
3.1.1.3. YY1
3.1.1.4. Sp1
3.1.1.5. CREB
3.1.1.6. Facteurs tissu-spécifiques
3.1.2. Coordination de l’expression des différents constituants du système de phosphorylation oxydative
3.1.3. Cofacteurs transcriptionnels
3.1.3.1. PGC-1
3.1.3.2. PRC
3.1.3.3. PGC-1ß
3.1.3.4. HCF
3.2. Régulations post-transcriptionnelles de l’expression de sous-unités du complexe I 
3.2.1. Régulation de l’expression de la sous-unité 75 kDa par le fer
3.2.2. Régulation de l’expression de la sous-unité 18 kDa (AQDQ) par phosphorylation
3.3. Facteurs d’assemblage 
4. Etude de l’expression des sous-unités du complexe I mitochondrial humain 
MATERIELS ET METHODES
A/ Analyse de promoteurs 
1. Extension d’amorce
1.1. Principe
1.2. Protocole
1.3. Solutions utilisées
2. Vecteurs plasmidiques utilisés
3. Préparations des clones plasmidiques concernant le gène NDUFS8
3.1. Description des constructions
3.2. Réactions PCR
3.3. Préparation des inserts et ligations
3.4. Solutions utilisées
4. Préparations des clones plasmidiques concernant le gène NDUFS7
4.1. Description des constructions
4.2. Réaction PCR
4.3. Préparation des inserts et ligations
5. Transformations
5.1. Protocole
5.2. Solutions utilisées
6. Préparation d’ADN plasmidique
6.1. Protocole
6.2. Solutions utilisées
7. Culture de cellules eucaryotes
8. Transfection transitoire
8.1. Principe
8.2. Protocole
9. Analyse informatique
10. Réactions de gel-retard
10.1. Principe
10.2. Protocole
11. Mutagenèse dirigée
11.1. Promoteur NDUFS8
11.2. Promoteur NDUFS7
B/ Etude du protéome mitochondrial 
1. Préparation de mitochondries
1.1. Mitochondries de placenta
1.2. Mitochondries de cellules en culture
1.3. Solutions utilisées
2. Culture de cellules eucaryotes
3. Electrophorèse bidimensionnelle
3.1. Principe
3.2. Préparation des échantillons protéiques
3.3. Focalisation sur gradient de pH
3.3.1. Préparation des gradients
3.3.2. Réhydratation des bandelettes IPG et focalisation
3.4. Equilibration, SDS-PAGE et coloration
4. Identification des protéines par spectrométrie de masse
RESULTATS
A/ Analyse du promoteur du gène NDUFS8 
1. Détermination du départ de transcription
2. Caractérisation de la région promotrice
3. Fixation de facteurs de transcription dans la région promotrice
4. Analyse des sites YY1 et Sp1 par mutagenèse dirigée
B/ Analyse du promoteur du gène NDUFS7 
1. Caractérisation de la région promotrice
2. Analyse des sites NRF-1 et Sp1 par mutagenèse dirigée
C/ Etude du protéome mitochondrial 
1. Extraction de mitochondries
2. Analyse des cartes de références et identification des protéines
3. Etude de l’expression des protéines mitochondriales en fonction de la concentration en fer
DISCUSSION 
Analyse du promoteur du gène NDUFS8
Analyse du promoteur du gène NDUFS7
Limites des études de promoteur et intérêt de l’analyse protéomique
Préparation des cartes du protéome mitochondrial
Etude de l’expression des protéines mitochondriales en fonction de la concentration en fer
CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE 
ANNEXES
Annexe I
Annexe II

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