TECHNIQUES MOLECULAIRES DE DETECTION ET GENOTYPAGE DU PAPILLOMAVIRUS HUMAIN

Techniques de génotypage

 Le principe du gé notypage repose sur une technique de PCR pour am plifier l’ADN cible suivie d’une technique de révélation qui varie selon les fabricants. 

Génotypage par séquençage 

Consiste à dé terminer la séquence d’une région située au niveau du gène L1 (région qui représente la base de définition des différents génotypes) pour la comparer par la suite à l’ensemble des séquences génomiques disponibles dans la banque de données NCBI ou GenBank à l’aide du logiciel Blast . Cette méthode est considérée comme la référence mais elle présente comme inconvénient principal de ne pas pouvoir analyser les infections multiples. De plus, son utilisation en routine demeure relativement fastidieuse . 

Génotypage par sondes immobilisées sur bandelettes

 C’est une technique qui repose sur l’amplification, par PCR, de région cible spécifique de type de HPV (au sein du gène L1 le plus souvent) en utilisant des amorces biotinylées. Un contrôle interne est prévu dans le kit permettant l’amplification d’un gène témoin (gène de ménage) observé dans tous les tissus humains tel que HLA-DPB1 ou GAPDH. Les amplicons biotinylés sont ensuite 23 hybridés avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques de types de HPV qui sont immobilisées en lignes parallèles sur des bandelettes de nitrocellulose. Après hybridation et lavage stringent, le conjugué streptavidine-phosphatase alcaline est ajouté et se lie à tout hybride biotinylé formé. L’incubation avec le chromogène BCIP/NBT forme un pré cipité violet au niveau des l ignes réactionnelles permettant une interprétation visuelle des résultats (Figure n° 11). Figure n° 11 : Principe de génotypage par hybridation inverse sur bandelettes [43]. Plusieurs tests ont à ce jour fait la preuve de leur efficacité tel que INNO-LiPA HPV Genotyping Extra® et Linear Array HPV Genotyping test®. 

Génotypage par puce à ADN 

Le principe est proche de celui de l’hybridation inverse sur bandelettes mais le support de l’hybridation, sur lequel sont fixées les sondes sous forme de spots bien distincts, est plus varié (type lame en verre ou en plastique ou fond de tube tronqué) et de taille différente (macro- ou microarrays). La révélation peut être 24 soit colorimétrique soit fluorimétrique, selon le marquage des amorces utilisées pour la PCR, avec une lecture automatisée. Cette technique, simple et rapide, permet également de détecter les infections multiples (Figure n° 12). Figure n° 12 : Principe de génotypage par hybridation inverse sur puces à ADN . 

Génotypage par technologie d’array en suspension ou Luminex®

 Le principe repose sur l’utilisation de microbilles de polystyrène couplées à des sondes oligonucléotidiques spécifiques de chaque génotype d’HPV . Les billes sont marquées par un fluorophore spécifique pour chaque type tandis que l’amplicon est marqué par un a utre fluorophore. L’analyse est effectuée par cytométrie de flux à 2 lasers permettant de détecter simultanément des réactions multiples dans un même tube (figure n°13). 25 Figure n° 13 : Principe de génotypage par technique Luminex® . 

 PCR multiplex en temps réel au SYBR Green

Le SYBR Green est un agent intercalant et son émission fluorescente augmente lorsque qu’il est lié à l’ADN double brin. Lors de la réaction d’amplification par PCR, une augmentation de la fluorescence est associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN double brin naissant [58, 59], (figure n°14).