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Origine de l’étude

La biologie moléculaire de laboratoire moderne, telle qu’on la connait, est difficilement envisageable sans les techniques électrophorétiques, utilisées en routine pour purifier et analyser des acides nucléiques de tailles variables. D’abord mises en œuvre avec des gels d’amidon dans les années 1950, elles ont été considérablement améliorées au cours des années pour aboutir au format capillaire actuel. Ces développements ont ouvert la voie à l’ère de la génomique, ce dont atteste le procédé de séquençage de Sanger. Ce procédé est fondé sur le codage des bases terminales d’un fragment d’ADN en couleurs spécifiques, couplé à une mesure de taille par électrophorèse pour évaluer sa position génomique. Cette combinaison de modification physico-chimique et de séparation en taille conduit à la reconstitution d’une séquence d’ADN. Les développements successifs et l’automatisation des techniques de séquençage, couplés aux progrès de la bioinformatique, ont contribué à l’explosion de la génomique dans les années 2000 avec, comme point d’orgue, la publication de la séquence du génome humain en 2001. Nos travaux s’inscrivent dans le cadre de l’innovation pour l’analyse génétique, où l’on vise à développer des outils et des technologies pour accélérer l’analyse des informations du génome en intégrant des fonctions de séparation, de concentration et de détections spécifiques de séquences par exemple.
Ces travaux de thèse font suite à ceux menés par Hubert Ranchon au cours de sa propre thèse portant sur la séparation d’ADN sans matrice solide sur puce microfluidique1. Le procédé de séparation repose sur un actionnement hydrodynamique et électrique bidirectionnel dans une solution viscoélastique. Dans ces conditions opératoires, Hubert a montré que la migration de l’ADN était dépendante de sa taille. L’introduction d’une constriction dans le canal a aussi permis de provoquer la concentration des ADN et leur séparation simultanée. Ces découvertes ont fait l’objet de deux brevets pour la séparation (WO 2014020271 A1) et la concentration (WO 2016016470 A1) qui ont été licenciés à la société Picometrics Technologies à la suite d’un travail de maturation mené par Vincent Picot.
1 Ranchon, H. Développement d’outils analytiques par et pour la microfluidique: caractérisation d’écoulements d’objets dissous et intégration d’un système de séparation sans matrice de biomolécules. (Université Paul Sabatier-Toulouse III, 2013).
Logiquement, l’intégration de fonctions de concentration, de séparation et de détection dans une puce microfluidique permet l’analyse sensible de l’ADN. Ainsi nos travaux ont consisté à développer et optimiser cette technologie microfluidique, nommée µLAS (micro laboratoire pour la séparation et l’analyse de l’ADN), et démontrer son potentiel applicatif pour des problématiques biologiques telles que le diagnostic de la maladie de Huntington, ou l’analyse de l’ADN circulant dans le sang pour le diagnostic et le suivi du cancer.
Nos travaux de thèses ont été menés en collaboration avec Picometrics Technologies, avec la motivation d’établir des preuves de concept pouvant être ensuite transférées industriellement. Par exemple, l’intégration d’une fonction de détection de séquences spécifiques a fait l’objet d’un nouveau brevet (FR1756234). Nous avons également collaboré avec l’équipe de Pierre Cordelier du Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (CRCT) et l’équipe de Vincent Dion de l’Université de Lausanne (UNIL), qui nous ont apporté leur expertise sur les problématiques biologiques et nous ont fourni des échantillons biologiques sur l’ADN tumoral circulant et la maladie de Huntington, respectivement. La fabrication de plusieurs générations de puces a été réalisée dans la salle blanche du LAAS. La préparation des échantillons et toutes les étapes pré-analytiques ont été développées et menées dans la plateforme de biotechnologie du LAAS, de même que l’observation avec la plate-forme microscopie du LAAS.

Organisation du manuscrit

Ce manuscrit abordera la problématique de l’ADN résiduel (ou ADN en faible concentration) et les challenges associés à son analyse, notamment en termes de sensibilité de détection.
Dans notre premier chapitre, l’exemple de l’ADN circulant dans le sang à très faibles concentrations nous permettra d’illustrer ces challenges. Après avoir défini l’ADN circulant et montré sa pertinence comme biomarqueur du cancer, nous nous intéresserons aux technologies utilisées pour son analyse, et discuterons de leurs limitations. Nous montrerons qu’une étape de concentration est souvent nécessaire pour atteindre des sensibilités de détection pertinentes. Les différentes méthodes de concentration de la littérature seront discutées afin de montrer qu’il existe des opportunités pour le développement de technologies.
Dans notre second chapitre, nous introduirons la technologie µLAS que nous avons développée pour l’analyse de l’ADN résiduel. Après avoir présenté les principes sur lesquelles reposent les fonctions de séparation et de concentration, nous exposerons les différents développements qui ont été menés pour obtenir un système fonctionnel, robuste et performant. Afin d’évaluer la pertinence de µLAS pour l’analyse de l’ADN résiduel, ces performances seront mises en perspective par rapport aux technologies décrites dans le chapitre premier.
Dans notre troisième chapitre, nous présenterons les premiers résultats de développement de la fonction de détection spécifiques de séquences, dernière brique pour l’obtention d’un système d’analyse total. Cette fonction est notamment nécessaire pour la détection de mutations pouvant servir de biomarqueurs cancéreux. Nous montrerons que l’approche mise en place permet la détection de séquences directement en volume, par amplification du signal à bruit de fond constant. Ces résultats font l’objet d’un brevet (FR1756234).
Dans notre quatrième chapitre, nous chercherons à évaluer le potentiel applicatif de µLAS pour la mesure de fragments de séquences répétés à l’origine de la maladie de Huntington. Nous mettrons notamment à profit la sensibilité de µLAS pour proposer l’analyse d’échantillons faiblement amplifiés, une approche rarement mise en œuvre jusqu’à présent qui peut être considéré comme un cas d’ADN résiduel. Ces travaux sont présentés sous la forme d’un article qui a été accepté à la publication sous réserve de révisions par la revue Nucleic Acids Research.
Enfin dans notre cinquième chapitre, nous appliquerons µLAS à l’analyse de l’ADN résiduel circulant. Nous montrerons que notre technologie a la sensibilité nécessaire pour établir des profils de distribution en tailles et en concentration de l’ADN circulant sous son format microfluidique et particulièrement sous son format capillaire industriel développé par Picometrics Technologies. Par ailleurs, nous présenterons une approche qui consiste à minimiser les étapes de préparation de l’échantillon sanguin pour procéder à l’analyse du plasma sans extraction préalable de l’ADN.

Table des matières

Remerciements
Table des matières
Introduction
Origine de l’étude
Organisation du manuscrit
Chapitre 1. Technologies pour l’analyse de l’ADN résiduel
1.1. L’ADN circulant, définition et lien avec le cancer
1.1.1. Définition de l’ADN circulant
1.1.2. ADN circulant et ADN tumoral circulant, les mécanismes de libération dans la circulation
1.1.3. De l’intérêt de la biopsie liquide, et plus particulièrement de l’échantillon sanguin
1.1.4. De l’intérêt du cfDNA et ctDNA parmi les autres biomarqueurs de la circulation
1.2. Approches, limitations et méthodes pour l’utilisation de l’ADN circulant comme biomarqueur du cancer
1.2.1. Une approche globale : la distribution en taille du cfDNA
1.2.1.1. Concentration et fragmentation de l’ADN circulant
1.2.1.2. DNA Integrity Index
1.2.2. Une approche ciblée : les altérations de séquence du ctDNA
1.2.3. Vers la standardisation des protocoles pré-analytiques (et analytiques)
1.3. Technologies pour l’analyse de l’ADN circulant
1.3.1. Mesurer la concentration du cfDNA : les techniques spectroscopiques et fluorimétriques
1.3.2. Mesurer la taille du cfDNA : les techniques électrophorétiques de séparation
1.3.2.1. L’électrophorèse capillaire
1.3.2.2. Amélioration de la sensibilité de détection
1.3.2.3. Les technologies microfluidiques d’électrophorèses
1.3.3. L’amplification par PCR pour la détection de l’ADN résiduel
1.3.3.1. Quelques éléments sur l’amplification par qPCR et son application au cfDNA
1.3.3.2. La PCR digitale
1.3.4. Les opportunités pour de nouvelles technologies microfluidiques de concentration pour l’analyse de l’ADN résiduel
1.3.4.1. La microfluidique et les laboratoires sur puce
1.3.4.2. Les techniques microfluidiques de concentration de l’ADN
1.3.4.2.1. Les méthodes de stacking
1.3.4.2.2. Les méthodes de focalisation par gradient
1.3.4.2.3. Les méthodes de capture
1.3.4.2.4. Autres techniques de concentration
Conclusion du chapitre 1
Références du chapitre 1.
Chapitre 2. μLAS : un laboratoire sur puce pour l’analyse de l’ADN résiduel
2.1. Principe de fonctionnement de μLAS
2.1.1. Une première innovation : la séparation d’espèces chargées sans matrice solide
2.1.1.1. De la difficulté de séparer de l’ADN sans matrice solide
2.1.1.1.1. Cas d’une particule chargée
2.1.1.1.2. Cas de l’ADN
2.1.1.2. De l’importance de la hauteur de l’ADN dans le canal
2.1.1.2.1. Chromatographie hydrodynamique et méthodes dérivées
2.1.1.2.2. Méthode de fractionnement par couplage Flux-Force
2.1.1.3. L’utilisation d’un fluide non Newtonien pour générer une force transverse à l’écoulement sous l’action de champs hydrodynamique et électrophorétique
2.1.1.3.1. Cas des fluides Newtoniens
2.1.1.3.2. Cas des fluides non Newtoniens
2.1.1.3.3. Expression de la force transverse pour un fluide non newtonien
2.1.1.4. La séparation par μLAS
2.1.2. Une seconde innovation : la concentration et la séparation simultanées de l’ADN
2.1.3. Présentation de la concentration sélective d’un 100 bp ladder
2.2. Développement et optimisation de μLAS pour l’analyse de l’ADN
2.2.1. Description du montage et de l’expérience de séparation par μLAS
2.2.2. Le design de la puce microfluidique
2.2.2.1. Le choix du matériau
2.2.2.2. Les dimensions du canal
2.2.2.2.1. La hauteur du canal
2.2.2.2.2. La largeur et la longueur du canal
2.2.2.3. La géométrie de la constriction
2.2.2.4. Puces à double canaux
2.2.3. La formulation du tampon.
2.2.4. Les paramètres d’actionnement
2.3. Précisions analytiques de μLAS
2.3.1. La gamme de taille et les différents types d’acides nucléiques
2.3.2. La précision de l’analyse par μLAS
2.3.2.1. Mesure de la taille
2.3.2.2. Mesure de la concentration
2.3.3. Facteurs de concentration et sensibilité de μLAS
2.4. Comparaison de μLAS avec les systèmes d’électrophorèses commerciaux
Conclusion du chapitre 2
Références du chapitre 2
Chapitre 3. Vers la détection spécifique de séquences de l’ADN.
3.1. Principe de détection de séquences spécifiques
3.1.1. Détection par fluorescence en surface
3.1.2. Détection par fluorescence en volume
3.1.3. Principe de détection avec μLAS
3.2. Les premières preuves de concept
3.2.1. La séparation de l’ADN simple brin
3.2.2. Démonstration de la concentration sélective du complexe sonde-cible
3.2.3. Concentration du complexe avec différents ratio sondes/cibles
3.2.4. Les facteurs de concentration
3.2.5. La compatibilité avec de l’ADN extrait de plasma
Conclusion du chapitre 3
Références du chapitre 3
Chapitre 4. Application au diagnostic de la maladie de Huntington
Conclusion du chapitre 4
Chapitre 5. Application à l’analyse de l’ADN circulant
5.1. Analyse d’échantillons purifiés
5.1.1. Extraction de l’ADN plasmatique
5.1.1.1. Origine et conditionnement du plasma
5.1.1.2. Comparaison des méthodes d’extraction de cfDNA
5.1.2. Séparation d’ADN circulant par μLAS
5.1.3. Séparation d’ADN circulant par BIABooster
5.1.3.1. Présentation de la technologie BIABooster
5.1.3.2. Résultats de séparation d’ADN purifié
5.2. Manipulation directe du plasma sur puce pour l’analyse du cfDNA
5.2.1. Compatibilité de μLAS avec des échantillons plasmatiques
5.2.2. Influence du tampon de séparation sur le plasma
5.2.3. La digestion des protéines du plasma
5.2.4. Le marquage de l’ADN circulant dans le plasma
5.2.5. La séparation de l’ADN circulant dans le plasma
Conclusion du chapitre 5
Références du chapitre 5
Conclusion et perspectives
Principaux résultats
Comparaison de μLAS avec les systèmes d’électrophorèses commerciaux
Limitations de μLAS
Perspectives de développement
Annexes
A. Fabrication des puces microfluidiques
A.1. Photolithographie optique
A.2. Gravure du silicium
A.3. Perçage des puces
A.4. Oxydation des puces
A.5. Encapsulation des puces
B. Caractéristiques des différentes puces utilisées pour nos travaux
C. DNA separation and enrichment using electro-hydrodynamic bidirectional flows in viscoelastic liquids, Lab on a Chip

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