Activités biologiques des extraits de Psychotriabridsoniae

 Les analyses des activités biologiques des extraits de la partie aérienne de Psychotriabridsoniae (Rubiaceae), une plante endémique de Madagascar, ont montré que l’extrait méthanolique présente une activité antimicrobienne intéressante contre les bactéries Gram (+), essentiellement sur Streptococcus pyogenes, avec une CMI de 39,06µg/ml et une CMB de 78,13µg/ml. Ce même extrait possède également un pouvoir antioxydant, avec une valeur importante de 3568mMTrolox/l d’extrait par la méthode DPPH, et une valeur de 22,59mMTrolox/l d’extrait par la méthode ORAC. Cette activité antioxydante peut être due à la présence des produits phénoliques dans la plante notamment à des flavonoïdes détectés lors du screening phytochimique. Outre les flavonoïdes, nous avons également détecté des iridoïdes, des stéroïdes et des tanins dans la partie aérienne de Psychotriabridsoniae. Mots-clés : Psychotriabridsoniae, Rubiaceae, phytochimie, activité antioxydante, activité antimicrobienne. Abstract: Biological activities of the Psychotriabridsoniae A.Davis & Govaertsextracts, Rubiaceae from Madagascar Biological tests revealed that the methanol extract of Psychotriabridsoniae (Rubiaceae) endemic to Madagascar inhibits Gram (+) bacteria, especially Streptococcus pyogenes with MIC value 39.06µg / ml and MBC value 78.13µg/ml. The methanol extract of the plant also showed an antioxidant activity with a high value of 3568mMTrolox /l of extract by DPPH method, and 22.59mMTrolox /l of extract by ORAC method. Antioxidant activity should be due to phenolic compounds such as flavonoids detected on phytochemical screening of the plant which also showed the presence of tannins, steroids and iridoids in its aerial part. Keywords: Psychotriabridsoniae, Rubiaceae, phytochemistry, iridoids, antimicrobial and antioxidant activity.

Psychotriabridsoniae

(Rubiaceae) est une plante endémique de Madagascar [1], qui n’a pas encore été très étudiée du point de vue phytochimique et biologique. Or, plusieurs plantes du genre Psychotria sont utilisées dans le monde pour le traitement de diverses maladies dont l’inflammation de la gorge, la dysenterie, la fièvre, les maux de dents, les maux d’oreilles et les blessures [2,3,4] ; les morsures de serpent [5]; les infections virales et bactériennes, et les inflammations [6,7,8]; l’hypertension, les dysfonctionnements cardiovasculaires, les perturbations mentales et les désordres alimentaires [9] , la malaria, la leishmaniose. [10], les maux d’estomac, les maladies vénériennes [11].Compte tenu de ces indications, nous avons axé nos recherches sur les propriétés biologiques de cette plante notamment les activités antimicrobienne et antioxydante. 

Collecte et identification

Les feuilles et inflorescences de Psychotriabridsoniaeont été récoltées en juillet 2011 dans la Réserve Naturelle Intégrale (RNI) de Tsaratanana, Commune de Manambato, District d’Ambanja, de la Région Diana(Madagascar). L’identification de la plante a été effectuée par les botanistes du Département Botanique du CNARP au sein duquel est déposé un herbier de référence Rakotondrafara A. 1056 (Figure 1). Figure 1:Herbier de Psychotriabridsoniae, Rakotondrafara A. 1056 (Source : Herbarium CNARP)

Criblagephytochimique

Le criblage phytochimique, suivant les méthodes adoptées par H.H.S. Fong et al. (1977), D.R. Dalton (1979), G. Cordell (1981), J. Bruneton (1987, 1993, 2009), A. Gurib-Fakim (1994), V. Plouvier et al. (1971) a servi pour la détection des familles de molécules présentes dans la plante. Ces méthodes utilisent des réactifs spécifiques pour chaque famille chimique à détecter. Les tests sont basés sur la formation de complexes insolubles ou de complexes colorés, à partir de poudre de plantes, ou d’extrait hydroéthanolique.

Préparation des extraits

Les feuilles et les inflorescences dePsychotriabridsoniae sont séchées, broyées puis macérées dans des solvants de polarité croissante : a) mélange dichlorométhane/hexane [60 :40] cinq fois, b) méthanol cinq fois.

Analyse des activités biologiques

L’analyse des activités biologiques concerne les tests sur les activités antibactériennes et les activités antioxydantes des extraits dichlorométhane et méthanolique de Psychotriabridsoniae. 

Tests des activités antimicrobiennes

Plusieurs méthodes ont été utilisées dont la dilution en milieu solide, l’antibiogramme, la bioautography et la microdilution en milieu liquide.

Screening antibactérien par la méthode de dilution en milieu solide

La méthode de dilution sur gélose en milieu solide est réalisée sur boîtes de Pétri en utilisant l’inoculateur de Steers. Elle permet de détecter le spectre antibactérien du produit testé à l’issue de l’inhibition ou non de la croissance des souches. Les échantillons sont testés à une dose de 100 mg/l sur des souches de référence. Ils sont mis en solution dans du DMSO pour faciliter leur diffusion dans l’agar. Le témoin négatif contient le DMSO et le témoin positif est constitué de l’Ofloxacine. L’incubation dure 24 h à 37 °C. Pour ce screening, 47 espèces bactériennes (30 Gram négatif et 17 Gram positif) provenant de souches de référence ont été utilisées. MADA-HARY, ISSN 2410-0315, vol. 5, 2016

Méthode de l’antibiogramme

La méthode utilisée est celle développée par Nielsen et al., 2000, Pyun et al., 2006 et Ngameni et al., 2009 afin de mesurer l’inhibition des bactéries par les extraits de la plante sur boites de Pétri [12,13,14]. Après ensemencement d’une quantité de 2ml de suspensions de bactéries, correspondant à 0,5 Mac Farland, à la surface d’un milieu gélosé Mueller Hinton dans une boîte de Pétri, des disques stériles, de 6mm de diamètre, type BioMérieux, imprégnés de 10µl d’extrait brut de concentration de la solution mère égale à 100 mg/ml soit 1mg/disque, y sont placés. Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées à 37°C pendant 24h. Après incubation, les zones d’inhibition de la croissance des bactéries par l’extrait, caractérisées par le diamètre d’halo d’inhibition autour de chaque disque, sont mesurées en mm [15]. La mesure est réalisée en triple.

Méthode par « bioautography »

La méthode est similaire à la méthode de l’antibiogramme, mais dont l’extrait à tester diffuse dans l’agar inoculé à partir de la plaque de chromatographie [16,17]. La technique utilisée est la bioautography par immersion. Elle consiste à immerger la plaque dans la gélose Mueller Hinton, ou à la placer dans une boite de Pétri et à la recouvrir ensuite du milieu gélosé. La plaque CCM contenant le spot de la solution de l’extrait méthanolique est placée dans une boite de Pétri, puis recouverte du milieu gélosé. Après solidification, les bactéries sont ensemencées et la boite de Pétri est ensuite incubée à 37°C pendant 24h [18]. Afin de permettre une meilleure diffusion des composés testés dans l’agar, les boites peuvent rester à basse température durant quelques heures avant incubation. La présence d’une bande claire entourant le spot sur la plaque indique la présence d’activité antibactérienne.

Méthode de microdilution en milieu liquide

Cette technique permet la détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) qui empêche la croissance d’un microorganisme après 24 heures d’incubation à 37 °C dans un milieu de croissance non spécifique, et de la Concentration Minimale Bactéricide (CMB), qui est la plus faible concentration de la substance antimicrobienne, laissant subsister moins de 0,01 % de survivants. La méthode utilisée est décrite par Fawole, 2009 et Kuete, 2009, utilisant une microplaque de 96 puits. [19][20] 100µl de l’extrait testé de concentrations égales à 5mg/ml et 7mg/ml sont dilués avec 95µl du Mueller Hinton Broth (MHB) puis répartis dans les 96 puits. 5 µl d’inoculum, standardisé entre 0,5 et 1 MacFarland, sont ajoutés dans chaque puits. Ces dilutions sont réalisées de façon à avoir des concentrations finales des extraits comprises entre 4,88 et 2500µg/ml d’une part et 6,83 et 3500µg/ml d’autre part. Un témoin négatif et un témoin positif sont utilisés : • Témoin négatif : 100µl du MHB • Témoin positif: 95 µl du MHB additionnés de 5 µl d’inoculum Les plaques sont ensuite recouvertes de papier aluminium stérile, puis incubées à 37°C pendant 24h. La CMI est évaluée par ajout de 40µl de solution de p-iodonitrotetrazoliumchloride, indicateur coloré en jaune, à une concentration de 0,2mg/ml dans chaque puits, après incubation à 37°C pendant 30mn [19]. Un virage de couleur au violet indique qu’il y a croissance bactérienne. La CMI est indiquée par la cupule qui contient la plus faible concentration d’extrait où aucun changement de coloration n’est observé. La CMB a été estimée par ensemencement de 5 µl de chaque puits qui ne présente pas de trouble sur Mueller Hinton Agar (MHA), et l’observation de colonies bactériennes après incubation à 37°C pendant 24h. La CMB correspond à la plus faible concentration où aucune colonie bactérienne n’est observée. L’évaluation finale des résultats est indiquée par le rapport de la CMB et de la CMI. Le produit testé est dit : – bactériostatique lorsque le rapport CMB/CMI est supérieur à 4 ; – bactéricide lorsque le rapport CMB/CMI est inférieur à 4.

Méthode de dilution en milieu solide pour le test antimoisissure

L’étude de l’activité antifongique est réalisée par la technique décrite par Favel et al. en 1994 [21]. Un millilitre de l’extrait de la plante de concentration finale égale à 1mg /ml est ajouté dans 19ml de milieu de culture PDA (PotatoDextrose Agar) maintenu à 45 °C. Le mélange est ensuite versé dans des boîtes de Pétri. Ces dernières sont mises à sécher pendant 15 mn à 37 °C. 10µl de chaque germe testé à une suspension correspondante à 0,5 MacFarland sont déposés en strie à la surface du milieu. Les boites de Pétri sont incubées à 25 °C pendant 72 h. Le résultat est observé par la croissance normale visible ou non des moisissures. Les témoins négatifs ont été préparés par spot des souches testées à la surface des milieux sans extraits.