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Objectifs
L’objectif principal de cette étude est de contribuer à une meilleure connaissance de l’utilisation de la spectrométrie de masse en analyse de biologie médicale. Notre but est de montrer comment elle intervient dans l’analyse des biomolécules dans de nombreux domaines médicaux, et comment elle supplante des méthodes traditionnelles d’analyse. Par sa fulgurance, sa précision, et sa facilité de mise en œuvre elle pourrait se montrer décisive pour certains diagnostique et révolutionner bien des domaines.
Méthodologie
La recherche de données sur l’application de la spectrométrie de masse en analyse de biologie médicale a consisté en la collecte et l’analyse d’articles de revues et d’ouvrages scientifiques en format physique ou électronique disponibles au niveau des sites spécialisés et des bases de données sur internet. Les documents rédigés en anglais ont été traduits en français à l’aide de Google traduction.
Applications de la spectrométrie de masse en microbiologie
Identification des microorganismes par MALDI-TOF
La prise en charge d’un patient suspect d’infection bactérienne repose classiquement sur l’identification de l’agent pathogène au site d’infection et sur le choix du meilleur traitement antibiotique, basé sur l’antibiogramme. L’identification d’un agent pathogène est donc cruciale, à la fois pour diagnostiquer une infection bactérienne mais aussi pour guider l’antibiothérapie. Les laboratoires développent et utilisent des méthodes fiables, toujours plus rapides pour l’identification bactérienne. La stratégie habituelle pour ces identifications est constituée de plusieurs étapes. Après des tests rapides d’orientation simples tels que la coloration de Gram ou les tests de catalase et d’oxydase, des tests phénotypiques, basés sur les caractéristiques biochimiques des bactéries, complètent l’identification. Depuis des décennies, cette stratégie était la seule applicable dans un laboratoire de routine bactériologique. L’unique évolution notable de ces techniques au fil des années a été leur miniaturisation et leur automatisation. Ces techniques sont coûteuses et nécessitent toujours plusieurs heures d’incubation avant l’obtention d’une identification d’espèce. Les méthodes utilisées dans les laboratoires de routine ne garantissent une identification fiable que pour les espèces les plus fréquemment rencontrées en clinique. Dans la plupart des cas, l’identification bactérienne a lieu 48 heures après la réception du prélèvement ; ce délai peut encore s’allonger dans le cas de bactéries ou champignons à croissance lente et/ou difficile. De plus, ces méthodes donnent seulement une identification au niveau du genre et/ou de l’espèce et ne sont souvent pas applicables pour une identification au niveau de la sous-espèce (typage), ce qui peut être important lors de la suspicion ou de risque de situation épidémique dans le domaine médical. Depuis quelques années, les tests de biologie moléculaire permettent une identification bactérienne rapide, applicable à tous les microorganismes, y compris les agents infectieux non cultivables. Les tests de biologie moléculaire utilisant des techniques PCR (Polymerase Chain Reaction) ne permettent malheureusement d’identifier que l’agent infectieux que l’on suspecte et pour lequel on dispose d’une technique. De plus, ces tests ne permettent pas toujours d’obtenir une identification discriminante jusqu’à l’espèce. Par ailleurs, le coût élevé et le haut niveau d’expertise technique requise font de la biologie moléculaire une technique actuellement inappropriée à l’identification de routine. Seuls quelques tests sont commercialisés pour l’identification rapide de pathogènes spécifiques, isolément ou en panel et d’autres applications utilisant la technologie des microarrays ont amélioré les stratégies d’identification en biologie moléculaire. Mais, le coût de ces tests et, parfois, la charge de travail reste élevée et représentent des facteurs limitants pour leur utilisation dans les laboratoires de microbiologie clinique. La spectrométrie de masse type MALDI-TOF s’avère être une technique innovante. Elle est récemment apparue sur le marché de la bactériologie. Elle permet à un laboratoire de routine, non seulement d’identifier un grand nombre de bactéries et de champignons, plus ou moins fréquemment rencontrés en clinique, mais aussi de réaliser cette identification de manière rapide, fiable et peu coûteuse [30].
Principe
La spectrométrie de masse permet l’étude du déplacement d’entités ioniques dans des champs électromagnétiques et peut permettre l’identification des micro-organismes grâce à l’analyse de leur contenu protéique [22]. L’ionisation de l’échantillon est essentielle et réalisée grâce à une matrice, en général, un dérivé de l’acide cinnamique, qui permet l’ionisation et la désorption homogène de l’échantillon biologique avec lequel elle est co-cristallisée sur une surface métallique. La source d’énergie est un faisceau laser pulsé émettant dans le domaine des ultraviolets. Les ions ainsi générés à partir d’une colonie finement étalée sur la cible en acier, sont séparés en fonction de leur temps de vol (TOF), c’est-à-dire la mesure du temps qu’ils mettent, lorsqu’ils sont soumis à une tension accélératrice pour parcourir la longueur du tube de vol. La zone de vol étant hors du champ électrique, la séparation des ions ne dépend que de la vitesse acquise lors de la phase d’accélération. Ainsi, les ions de rapport masse sur charge (m/z) le plus petit parviendront au détecteur les premiers. Pour chaque groupe d’ions de même rapport m/z, un signal est enregistré au niveau du détecteur sous la forme d’une fonction temps/intensité, l’ensemble des pics ainsi enregistrés constituant un spectre de masse [38]. La source d’ions de type MALDI, source dite « douce », permet la formation d’espèces ioniques principalement monochargées, la séparation des ions ne dépendant ainsi principalement que de leur masse. Parmi. les nombreux pics produits, les principaux correspondent à des protéines ribosomales et semblent spécifiques d’espèce et peu influencées par les variations intraspécifiques. Le spectre de masse obtenu est une sorte d’empreinte digitale spécifique et unique de la composition en protéines du microorganisme analysé, qui peut être comparé à une banque de données de spectres [30]. Les spectres générés à partir de bactéries entières sont ensuite comparés aux spectres de référence présents dans la base de données d’un système fourni avec l’équipement. Ces spectres de référence ont été obtenus à partir des souches types et d’isolats cliniques issus de collections internationales ou environnementaux. La base de données peut être enrichie par l’utilisateur La concordance d’un spectre obtenu à partir d’une bactérie étudiée avec ceux des souches de référence est traduite par un score qui indique le degré de confiance à accorder à l’identification comme montre le Tableau I. Lorsque l’identification par spectrométrie de masse est impossible, des méthodes génotypiques sont mises en œuvre, comme c’était le cas antérieurement, en cas d’échec d’identification conventionnelle.
Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I : GENERALITES SUR LES BIOMOLECULES
I-1- Glucides ou hydrates de carbone
I.1.1- Monosaccharides (ou oses)
I.1.2- Oligosaccharides
I.1.2.1- Disaccharides communs
I.1.2.1.1- Saccharose
I.1.2.1.2-α, α-tréhalose
I.1.2.1.3- Lactose, Cellobiose et Maltose
I.1.2.1.4-Isomaltulose et lactulose
I.1.2.2-Cyclodextrines
I.1.3- Polysaccharides
I.2- Lipides
I.2.1- Lipides neutres
I.2.2- Lipides polaires
I.2.3- Lipides simples
I.2.4- Acides gras
I.2.4.1- Acides gras saturés (AGS)
I.2.4.2- Acides gras mono insaturés(AGMI)
I.2.4.3- Acides gras polyinsaturés
I.3- Protéines
I.3.1- Définitions et caractéristiques générales
I.3.2- Eléments de structure des protéines
I.3.2.1- Acides aminés
I.3.2.2- Liaison peptidique
I.3.3- Conformation spatiale des protéines
I.3.4- Fonctions des protéines
I.4- Acides nucléiques
I.5- Synthèse des protéines
CHAPITRE II : SPECTROMETRIE DE MASSE
II.1- Définition
II.2- Historique
II.3- Principe et appareillage
II.3.1- Principe
II.3.2- Appareillage
II.4- Les étapes d’un spectromètre de masse
II.4.1 – Introduction de l’échantillon
II.4.2- Ionisation
II.4.3- Séparation d’ions ou analyse de masse
II.4.4- Détection d’ions
II.5- Aperçu du champ d’application de la spectrométrie de masse en biologie
CHAPITRE III : APPLICATIONS DE LA SPECTROMETRIE DE MASSE A L’ANALYSE DE BIOMOLECULES
III.1- Objectifs
III.2- Méthodologie
III.3- Applications de la spectrométrie de masse en microbiologie
III.3.1- Identification des microorganismes par MALDI-TOF
III.3.1.1- Principe
III.3.1.2- Comparaison de la spectrométrie de masse MALDI-TOF aux techniques traditionnelles d’identifications
III.3.2- Détection de la résistance aux antibiotiques
III.3.2.1- Détection spécifique de la résistance aux bêta-lactamines chez les entérobactéries et les bacilles à Gram négatif non fermentants.
III.3.2.2- Dépistage des Staphylococcus aureus résistants à la méticilline
III.3.2.3 – Détection des entérocoques résistant à la vancomycine
III.3.3- Détection de marqueurs de virulence
III.3.4- Etudes épidémiologiques
III.3.5- Génotypage de polymorphismes ponctuels par spectrométrie de masse Maldi-TOF
III.4- Applications en biochimie
III.4.1- Analyse des stéroïdes
III.4.1.1- Caractéristiques des stéroïdes
III.4.1.2- Dosage des stéroïdes.
III.4.1.2.1- Appareillage
III.4.1.2.2- Méthodes de dosages
III.4.1.2.3- Quantification et évaluation des performances analytiques
III.4.1.3- Principales indications cliniques tirant bénéfice de la spectrométrie de masse
III.4.1.3.1- Hyperplasies congénitales des surrénales
III.4.1.3.2- Autres insuffisances surrénaliennes
III.4.1.3.3- Syndromes de Cushing
III.4.1.3.4- Hypertensions d’origines endocriniennes
III.4.1.3.5- Hypo et hypergonadismes
III.4.2- Spectrométrie de masse en tandem et maladies métaboliques héréditaires
III.4.2.1- Acquisition par balayage d’ions parents : exemple de la réalisation de profils d’acylcarnitines
III.4.2.2- Acquisition en mode MRM : exemple de l’analyse du métabolisme de la créatine
III.4.2.3- Analyse de perte de neutre : exemple de l’analyse d’acides aminés
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
