Comptage et expression des résultats

La détermination de la charge microbienne est faite par comptage des colonies et les résultats sont exprimés en UFC (nombre d’Unités Formant Colonies) / ml d’eau selon la formule mathématique ci-dessous. Seules les boîtes contenant entre 15 et 150 colonies au niveau de deux dilutions successives sont retenues pour le dénombrement (Dutruc-Rosset, 2003). N = ∑ colonies / Vml x (n1 x 0,1n2) xd1 Où : N: Nombre d’UFC par volume d’eau; ∑colonies: somme des colonies des boîtes interprétables; V: Volume de solution déposée (1ml); n1 : Nombre de boîtes considéré à la première dilution retenue; n2: Nombre de boîtes considéré à la seconde dilution retenue; d1 :Facteur de la première dilution retenue.

Identification de la microflore fongique isolée des eaux agricoles superficielles

après une série de repiquages successifs jusqu’à purification du champignon, La caractérisation et l’identification des espèces fongiques est basée sur l’observation macrosopiques et microscopiques des caractères morphologiques de l’espèce. Les progrès récents de la biologie moléculaire ont permis de proposer des outils d’aide à l’identification. Toutefois, la complexité du règne fongique fait, qu’à l’heure actuelle, ces outils ne peuvent pas encore remplacer complètement l’examen morphologique, qui reste la base de l’identification.5.2.1. Identification macroscopique L’identification morphologique repose sur des caractères macroscopiques sur les différents milieux de culture (dimension, couleur, texture, pigmentation du milieu, et croissance, aspect des colonies, de leur revers). 5.2.2. Identification microscopique Les caractères microscopiques tels que l’aspect du mycélium, des spores, conidies, des phialides, des conidiophores, structures de résistances et éventuellement la forme sexuée ou asexuée constituent les bases de critères principaux de l’identification des champignons (Cahagnier et Richard-Molard, 1998).

Remarque: Une bactérie mobile doit se déplacer dans le champ microscopique avec un mouvement qui lui est propre, les autres bactéries restant immobiles ou se déplaçant dans d’autres directions. Attention cette mobilité ne doit pas être confondue avec les mouvements browniens qui sont des mouvements désordonnés de particules (sans déplacement véritable) dus à l’agitation thermique des molécules de liquide ni avec les • Les spores, Leur présence permet à elle seule de ranger les bactéries aérobies dans la famille des Bacillaceae. De plus la spore et sa position permettent la classification des bactéries en groupes à l’intérieur d’une famille.

La coloration de Gram

La coloration de Gram est la base de l’identification d’une souche bactérienne. Elle doit être parfaitement maîtrisée car c’est le point de départ du choix des examens complémentaires à effectuer, des milieux à ensemencer etc. La coloration de Gram est une coloration qui teste l’alcoolo – résistance d’une souche bactérienne. En effet, les différences de coloration des bactéries reposent sur des différences de constitution de la paroi.Au terme du processus de coloration, les bactéries dites « Gram Négatives » apparaissent roses tandis que les bactéries dites « Gram Positives » sont colorés en bleu foncé/violet (rem : certaines bactéries telles que les Bacillus, apparaissent parfois roses et violettes sur le même frottis, on les dit « Gram labiles » et les différences de coloration sont dues à des différences d’âge des bactéries). 5.3.5. Test oxydase Ce test est à la base de l’identification des bactéries. Ce test permet de mettre en évidence une enzyme : la phénylène –diamine- oxydase des bactéries à partir de leur culture en milieu gélosé. Cette enzyme est capable d’oxyder un réactif : le N diméthyl-paraphénylène -diamine.

Caractérisation à l’aide de galeries API 20E

La galerie API 20 E est un système standardisé pour l’identification des Enterobacteriaceae et autres bacilles à Gram négatif (dont les Vibrionaceae), comprenant 21 tests biochimiques miniaturisés, ainsi qu’une base de données. Elle comporte 20 microtubes contenant des substrats déshydratés, et permet aussi la réalisation de tests en anaérobiose (ajout de paraffine). La suspension bactérienne, inoculée dans 5 ml d’eau physiologique stérile à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, est préparée à partir d’une colonie isolée suite à plusieurs repiquages successifs. L’ajout de réactifs s’avère nécessaire pour certains tests. L’incubation se fait à 36°C ± 2°C pendant 18 à 24 heures.La révélation des deux tests NO3 et TRP est faite en mettant les tests d’assimilation à l’abri d’une contamination par l’air. Une goutte de chaque réactif (NIT 1 et NIT 2) est ajoutée dans la cupule NO3. Après 5 minutes, une couleur rouge indique une réaction positive, à noter sur la fiche des résultats. Une réaction négative peut être due à la production d’azote (éventuellement signalée par la présence de microbulles). Pour cela, 2-3 mg de réactif de Zn sont ajoutés dans la cupule NO3. Après 5 minutes, une cupule restée incolore indique une réaction positive. Si la cupule devient rose-rouge, la réaction est négative.