La galle du collet ou « crown gall »

Au début du 20ème siècle, plusieurs études ont porté sur cette maladie, la principale raison de cet intérêt étant que crown gall était considérée comme un problème majeur dans les pépinières d’amandiers, de pommiers, de pêchers, et de pruniers. Ce sont toutes des espèces ligneuses qui sont propagées par greffage de boutures. Ces greffes provoquent des blessures qui sont généralement recouvertes de terre et fournissent ainsi un excellent point d’entrée pour les agrobactéries . D’autres espèces telles que le rosier, le chrysanthème, la vigne sont également sensibles à Agrobacterium . En raison de leur grande sensibilité au crown gall, des plantes telles que le datura (Datura stramonium) et le tournesol (Helianthus annuus) sont utilisées comme hôtes au cours d’essais, pour analyser le degré de virulence d’A. tumefaciens. Le kalanchoé (Kalanchoe daigmontiana) est également utilisé au laboratoire, quoiqu’il constitue un hôte moins sensible que le datura.
Au départ, l’effort scientifique a porté sur les recherches des mécanismes d’induction de la tumeur de crown gall, dans l’espoir de comprendre le mécanisme de l’oncogenèse en général et appliquer ces connaissances au développement du traitement du cancer chez les animaux et les humains. Les tumeurs de crown gall peuvent s’observer non seulement au niveau du collet, partie de la plante située à la jonction tige-racine mais aussi sur des racines, des tiges et plus rarement des feuilles. On peut les induire expérimentalement par blessure et inoculation sur de nombreux hôtes. Ces tumeurs dont l’extension peut-être parfois considérable, détournent les flux de métabolites de la plante, abaissant par-là même la croissance, la vigueur et le rendement. Sur des tissus jeunes, leur développement peut conduire à un «étranglement» des tiges ou des racines, et à un arrêt de la circulation de la sève.
En 1907, Smith et Townsend identifient la nature bactérienne de la galle du collet en isolant l’agent responsable, Bacterium tumefaciens, devenu par la suite Agrobacterium tumefaciens. Avec les progrès de la culture in vitro, Braun et White en 1943 montrent que l’on peut, à la différence des tissus normaux, cultiver les tissus tumoraux et les entretenir de façon indéfinie sur un milieu simple contenant seulement du saccharose et des sels minéraux, la prolifération se poursuivant en l’absence de la bactérie pathogène. Une modification identique est observée après greffe de fragments de tumeur sur des plantes saines.

Agrobacterium

Description : Les agrobactéries vivent dans le sol et plus spécialement dans la rhizosphère. Elles ont pu être isolées dans à peu près tous les pays du monde (Bergey, 1984).
Ces bactéries se présentent sous forme de bacilles de 0,6 à 1µm de largeur et de 1,5 à 3µm de longueur. Elles sont mobiles grâce à 1 à 6 flagelles et ne forment pas de spores. Elles vivent en aérobiose, car elles possèdent un métabolisme du type respiratoire, avec l’oxygène comme accepteur final d’électron. Elles sont toutefois capables de croître sous des tensions réduites d’oxygène dans les tissus de la plante et pour certaines, en anaérobiose en présence de nitrate. La température optimale de croissance se situe entre 25°C à 28°C. En milieu solide, elles forment des colonies convexes, circulaires, lisses et de couleur beige clair .
Classification : Le genre Agrobacterium appartient à la famille des Rhizobiaceae (Bergey, 1984). Sa classification initiale fut basée sur le pouvoir pathogène et le type de symptômes induits. Il comprend au moins cinq espèces :
A. tumefaciens, espèce la plus connue, agent du crown gall (Smith et Towsend, 1907) ; A. rhizogenes, responsable du hairy root (Riker et al.,1930) ; A. rubi, induisant la formation de tumeurs aériennes sur Rubus sp. notamment (Kersters et De Ley, 1984) ; A. vitis, responsable du crown gall de la vigne (Ophel et Kerr, 1990) ; A. radiobacter, regroupant des souches non pathogènes, ayant probablement perdu leur plasmide Ti (Bergey, 1984).
Cette classification se fonde sur des caractères phytopathologiques liés à la présence des plasmides Ti ou Ri, éléments mobiles du génome, pouvant être perdus ou acquis par conjugaison. De tels caractères ne permettent pas de générer une classification stable.
Diverses méthodes ont été utilisées pour étudier les espèces naturelles du genre Agrobacterium comme l’analyse numérique des caractéristiques phénotypiques (Kersters et al., 1973), les tests biochimiques et physiologiques (Keane et al., 1970 ; Kerr et Panagopoulos, 1977 ), les mesures de la stabilité des hybrides ADN/ADN (De Ley et al., 1973), la comparaison des électrophorégrammes de protéines solubles (Kersters et De Ley, 1975) et les profils des acides gras (Sawada et al., 1992; Bouzar et al.,1993). Les résultats obtenus par toutes ces méthodes, indiquent l’existence de trois groupes génétiquement et phénotypiquement distincts, n’incluant pas Agrobacterium rubi. Ces groupes correspondent aux biotypes (ou biovars) 1, 2, et 3 déterminés par Keane et al., dès 1970, reconnus par la suite comme espèces (Bradbury, 1986 ; Sawada et al.,1993). Chez Agrobacterium, il est généralement admis que les biovars (ou biotypes) ont un statut d’espèces.
Le biotype I comprend la plupart des souches d’A. tumefaciens. Il inclut la souche type A. tumefaciens selon ses caractères pathogéniques tumoraux aussi bien que la souche type A. radiobacter non pathogène alors que la majorité des souches d’A. rhizogenes appartiennent au biotype II. Cependant la souche A. rhizogenes 2659 appartient au biotype I (Costantino et al.,1981). Le biotype III regroupe les souches d’A. vitis . A. rubi définirait au moins un quatrième biotype caractérisé en termes génotypique et phénotypique.

Relations Agrobacterium-plante

Organisation générale des plasmides Ti et Ri : Les plasmides Ti et Ri, déterminants essentiels de la pathogénicité des agrobactéries, ne sont présents qu’en un seul exemplaire dans les bactéries qui les hébergent. Ce sont des plasmides de haut poids moléculaire. A titre d’exemple, le plasmide Ri2659 de la souche d’A. rhizogenes a une taille d’environ 200kb (Costantino et al., 1981). Ces mégaplasmides sont constitués d’un nombre de régions fonctionnelles qui sont : la région de l’origine de réplication (ori) et la région d’incompatibilité (inc); les gènes de transfert conjugatif (tra) ; les gènes de virulence (vir) ; les gènes du catabolisme des opines (opc) et les gènes du T-DNA . Par conséquent, ces plasmides peuvent être considérés comme un assemblage de groupes de gènes indépendants. Cette structure en «mosaïque» des plasmides Ti /Ri proviendrait probablement d’un transfert horizontal d’ADN. Un mécanisme de transposition a été proposé. Ainsi, dans le cas des plasmides Ti à octopine et du chromosome de P. savastanoï, les gènes iaa sont dans les 2 cas, liés à un élément IS51-like (Otten et al., 1992).
Sur le plan fonctionnel, on peut distinguer 2 groupes de gènes. Le premier constitué de la région ori, des gènes tra, des gènes vir et des gènes opc, est exprimé dans un contexte bactérien, le second (gènes du T-DNA) est exprimé dans un environnement eucaryote (plante).
Les régions du 1er groupe, non transférables à la cellule végétale, des plasmides Ti et Ri sont très comparables.

Reconnaissance et attachement des bactéries aux cellules végétales blessées

Dans les conditions naturelles, les cellules d’A. tumefaciens sont attirées vers les sites blessés, par chimiotactisme. Ceci est, en partie, une réponse à la libération de sucres et d’autres composés communs (acides aminés, dérivés phénoliques) exsudés par les plantes se produisant même lorsque les souches ont été curées de leur plasmide. Cependant, les agrobactéries qui hébergent le plasmide Ti répondent fortement parce qu’elles reconnaissent les composés phénoliques tels que l’acétosyringone, l’acide sinapinique, l’alcool coniférylique qui sont très attractifs même à très faible concentration (Winans, 1992). Ainsi, une des fonctions du plasmide Ti est de coder des récepteurs spécifiques qui sont insérés dans la membrane bactérienne et rendent Agrobacterium capable de reconnaître les cellules végétales blessées.
La capacité d’attachement d’une bactérie sur les tissus végétaux est un facteur qui influe fortement sur le développement ultérieur de l’interaction pathogène. L’attachement d’Agrobacterium aux cellules de plantes fait intervenir différents éléments génétiques déterminés par le chromosome : les loci chvA et chvB sont impliqués dans la synthèse et l’excrétion du ß-1-2-glucane ; le locus chvE est requis pour la reconnaissance du sucre activateur de l’induction des gènes vir et du chimiotactisme bactérien ;
le locus cel est responsable de la synthèse des fibrilles de cellulose permettant un ancrage, assez faible toutefois, de la bactérie à la paroi végétale.
le locus pscA (exoC) joue un rôle dans la synthèse à la fois du cycle glucane et de l’acide succino glucane ;
le locus chromosomique att de 20kb est constitué de gènes requis pour l’attachement de la bactérie à la cellule végétale .
La colonisation bactérienne est une étape essentielle et très précoce dans l’induction tumorale. Elle se produit juste avant qu’ A. tumefaciens s’attache à la surface cellulaire de la plante (Matthysse, 1996). A cet égard, un mutant attR d’A. tumefaciens qui a perdu la capacité à synthétiser des fibrilles de cellulose, est fortement affecté dans sa capacité à coloniser le système racinaire des plantes. Un tel mutant a également totalement perdu la capacité d’induire le développement des tumeurs sur les plantes . Les polysaccharides de la surface cellulaire semblent jouer un rôle important dans le processus de colonisation . Dans le cas d’A. tumefaciens, il a été observé que l’attachement de la bactérie à la plante était directement corrélé à la production d’un acide polysaccharidique.

Intégration du T-DNA dans le génome nucléaire de la plante

Une fois dans la cellule végétale, le complexe du brin-T est dirigé dans le noyau à travers la membrane nucléaire. A la différence des autres éléments mobiles, comme les transposons ou rétrovirus animaux, le T-DNA ne code aucune protéine impliquée directement dans son intégration. Par conséquent, seules les protéines bactériennes accompagnant le T-DNA dans la cellule végétale hôte et/ou les protéines de l’hôte végétal pourraient aider dans le processus d’intégration. Les seules protéines bactériennes connues jusqu’à présent qui atteignent la cellule végétale sont VirD2 et VirE2. Elles jouent un rôle important dans cette étape, ainsi que VirF qui, elle a un rôle mineur. De façon remarquable, VirE2 possède 2 signaux de localisation nucléaire de plantes (NLS), et VirD2 en contient un (Bravo Angel et al., 1998). Ceci indique que ces 2 protéines jouent un rôle probable important, une fois que le complexe est dans la cellule végétale en matière d’adressage du complexe vers le noyau de la cellule . En accord avec ce qui précède, la délétion des NLS de l’une des deux protéines réduit mais n’inhibe pas totalement le transfert du brin-T et son intégration dans le génome nucléaire de la plante, suggérant que le ou les NLS de la seconde protéine, non mutée, peut assurer au moins partiellement cette fonction. En sus du rôle des NLS de VirD2 dans l’adressage du complexe-T vers le noyau, il apparaît que ces protéines sont impliquées dans l’intégration du complexe T dans le matériel génétique végétal. Ainsi la protéine MobA, équivalente à VirD2 et impliquée dans le transfert de plasmide par conjugaison, peut être transférée vers les cellules végétales et permet une intégration du TDNA dans le génome avec la même efficacité que VirD2 . Néanmoins, les principales enzymes responsables de l’intégration du complexe T sont d’origine végétale. Ainsi, deux lignées d’Arabidopsis isolées sur la base de leur hypersensibilité aux UV et rayons-γ, sont également défectives en ce qui concerne l’intégration du T-DNA, indiquant que des fonctions liées à la réparation de l’ADN sont impliquées dans le processus d’insertion du T-DNA .
Un modèle a été proposé suggérant que l’association entre l’ADN de la plante et le TDNA est initiée à l’extrémité 3’du brin-T. Cette étape est suivie par la ligation de l’extrémité 5’ du brin-T à l’extrémité 3’ de l’ADN de plante, par l’intermédiaire du pont phosphotyrosine riche en énergie, qui lie la protéine VirD2 au T-DNA.
Une fois que le T-DNA est intégré de façon covalente à l’ADN nucléaire de la plante une, deux ou plusieurs copies de T-DNA peuvent être trouvées dans le génome nucléaire d’une même cellule végétale. De même, différents T-DNA peuvent être transférés, dans la même cellule végétale, par différentes bactéries .
Les données prises à partir de différentes espèces de plante montrent que le choix des sites d’intégration se fait apparemment au hasard, avec cependant une intégration préférentielle dans les régions en activité transcriptionnelle . Cette intégration n’est pas site spécifique et ne requiert pas de grandes étendues d’homologies mais se fait plutôt par recombinaison illégitime.

Oncogènes du T-DNA

Les gènes du T-DNA des plasmides Ti et Ri sont appelés « oncogènes » à cause de leur potentiel morphologique remarquable et parce qu’ils interfèrent avec des mécanismes variés de régulation de la division cellulaire. Par définition, un oncogène est capable par lui-même de causer une transformation néoplasique et de donner l’apparence du phénotype tumoral à la cellule qui le renferme. Chez les animaux, il a été démontré qu’un gène présent dans les cellules normales était l’homologue de l’oncogène viral. Ce gène est appelé proto-oncogène (c-onc) et l’oncogène viral correspondant est désigné par v-onc.
Chez A. tumefaciens, le terme oncogène semble approprié pour les gènes du T-DNA tels que iaaM et iaaH, ipt ou le gène 6b, capables par eux-mêmes, de causer la formation de structures tumorales (prolifération cellulaire) sur certains hôtes. Cependant, la présence d’homologue cellulaire n’a pas été rapportée pour ces cas.
Dans le cas d’A. rhizogenes, à l’exception des gènes aux1 et aux2 du TR-DNA des souches à agropine et de l’ORF13, aucun gène ne peut causer à lui seul une prolifération cellulaire. Néanmoins, des homologues cellulaires des gènes du T-DNA du plasmide Ri ont été décrits, clonés et analysés.

Table des matières

Chapitre I – INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 
Introduction 
1- La maladie 
1.1. La galle du collet ou « crown gall »
1.2. Le hairy root
2- Agrobacterium
2.1. Description
2.2. Classification
3- Relations Agrobacterium-Plante 
3.1. Organisation générale des plasmides Ti et Ri
3.1.1. la région de virulence
3.1.2. la région du catabolisme des opines
3.1.3. la région T
3.1.4. relations entre plasmides Ti et Ri
3.1.5. données à partir des séquences nucléotidiques
3.2. Bases moléculaires de l’interaction bactérie-plante
3.2.1. reconnaissance et attachement des bactéries aux cellules végétales blessées
3.2.2. induction du système de virulence bactérien
3.2.3. formation du complexe nucléoprotéique transféré
3.2.4. intégration du T-DNA dans le génome nucléaire de la plante
3.2.5. expression des gènes du T-DNA
3.3. Les opines
3.3.1. structure
3.3.2. importance dans l’interaction Agrobacterium-plante
3.4. Classification des plasmides
4- Les oncogènes du T-DNA 
4.1. Oncogènes du T-DNA des plasmides Ti
4.1.1. les oncogènes principaux
4.1.2. les autres différents oncogènes
4.2. Oncogènes du T-DNA des plasmides Ri
4.2.1. structure du T-DNA
4.2.1.1. TR-DNA
4.2.1.2. TL-DNA
4.2.2. les différents oncogènes
4.2.2.1. rolA
4.2.2.2. rolB
4.2.2.3. rolC
4.2.2.4 rolD
4.2.2.5. ORF13
5- Les autres ORFs 
5.1. ORF3
5.2. ORF8
Chapitre II – MATERIELS ET METHODES 
1- Matériels
1.1. Souches bactériennes et milieux de culture
1.2. Plasmides utilisés
1.3. Matériel végétal et conditions de culture
2- Méthodes 
2.1. Techniques de biologie moléculaire
2.1.1. manipulations courantes
2.1.2. construction des plasmides
2.1.2.1. clonage de l’ORF8 sous son propre promoteur
2.1.2.2. clonage de l’ORF8 sous le contrôle du promoteur 35S de CaMV
2.1.2.3. clonage du promoteur ORF8 en amont du gène uidA
2.1.3. amplification par PCR
2.1.3.1. amplification du promoteur minimal 35S
2.1.3.2. analyse par PCR et RT-PCR de l’ORF8
2.1.4. extraction d’ADN génomique de tabac
2.1.5. séquençage d’ADN
2.2. Techniques de biologie végétale
2.2.1. obtention de plantes transgéniques
2.2.2. germination des graines
2.2.3. induction racinaire sur disques foliaires
2.2.4. métabolisme du NAA chez les plantules transgéniques
2.2.4.1. mesure de l’incorporation de l’auxine
2.2.4.2. analyse des dérivés métaboliques
2.2.5. mesure de l’activité GUS
2.2.6.ultrastucture cellulaire des cotylédons
2.3. Recherche des homologies de séquences
Chapitre III – RESULTATS 
1- Morphogenèse des plantes de tabac transgéniques 
1.1. Caractérisation des plantes transgéniques
1.1.1. résistance à la kanamycine
1.1.2. intégration de l’ORF8 dans le génome de plantes de tabac
1.1.3. recherche des transcrits
1.2. Phénotype des plantes transgéniques
1.3. Structure et ultrastructure cellulaires des cotylédons
2- Réponses des tissus transgéniques à l’auxine exogène 
2.1. Résistance à l’auxine
2.1.1. germination des graines en présence d’auxine
2.1.2. induction par l’auxine de la rhizogénèse sur disques foliaires
2.2. Métabolisme du NAA
3- Expression et inductibilité du promoteur de l’ORF8 
3.1. Activité GUS
3.1.1. spécificité tissulaire de l’expression
3.1.2. activation du promoteur de l’ORF8 par l’auxine
Chapitre IV – DISCUSSION ET PERSPECTIVES 
1- Phénotype des plantes pro8-ORF8 et 35S-ORF8 
2- Résistance à l’auxine 
3- Activité tryptophane-2-monooxygénase (T2M) 
4- Expression et inductibilité de l’ORF8 
CONCLUSION 
BIBLIOGRAPHIE 
ANNEXES 
Annexe 1 – Séquence nucléotidique de la jonction Pro8-GUS
Annexe 2 – Séquence du promoteur minimal 35S
Annexe 3 – Séquences de l’ORF8
3.1. Séquence nucléotidique de la partie codante de l’ORF8
3.2. Séquence protéique de l’ORF8
Annexe 4 – Article « The T-DNA ORF8 of the cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes Ri plasmid is involved in auxin response in trangenic tobacco »

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