CONTRIBUTION A L’ETUDE DES GRENOUILLES MANTELLA

Méthode d’études physico-chimiques des alcaloïdes 

Extraction d’alcaloïdes totaux

Principe L’extraction des alcaloïdes est fondée, en règle générale, sur le fait qu’ils existent à l’état de sels ou de combinaisons solubles d’une part, sur leur caractère basique d’autre part. Par conséquent, il en résulte la solubilité différentielle des bases et des sels dans l’eau et dans les solvants en fonction du pH. Méthode Les composés organiques avec les alcaloïdes sont extraits par un solvant organique. Le mélange ainsi obtenu est alors agité à plusieurs reprises avec une solution aqueuse acide. Les alcaloïdes se solubilisent sous forme de sels dans la phase aqueuse suivant la réaction : Au cours de cette opération, les impuretés restent en solution dans la phase organique. Les solutions aqueuses de sels d’alcaloïdes sont alcalinisées par une base pour régénérer les alcaloïdes. Les alcaloïdes sont extraits de nouveau par un solvant organique. L’épuisement de la phase aqueuse est poursuivi jusqu’à ce que tous les alcaloïdes soient repassés en phase organique.. [23] 

Chromatographie sur couches minces (ccm)

C’est une chromatographie d’adsorption solide – liquide. La phase mobile ou « éluant » constituée soit par un solvant unique, soit par un mélange de solvants, progresse par capillarité le long d’une phase stationnaire dite «adsorbant » solide, finement divisée, fixée au préalable sur une plaque de verre, d’aluminium ou de matière plastique. [24] [25] Chaque constituant de l’échantillon évolue avec sa vitesse propre derrière le front du solvant. N R3 R1 R2 + AH N R3 R1 R2 H + A °° _ 25 Cette vitesse dépend des forces électrostatiques retenant le composant sur l’adsorbant d’une part, de sa solubilité dans la phase mobile d’autre part. Généralement, les constituants de faible polarité sont élués plus rapidement que les composants polaires. Le comportement d’un constituant particulier dans un système chromatographique déterminé est défini par rapport à sa référence frontale notée Rf En pratique, la chromatographie sur couches minces permet : – l’analyse qualitative d’un mélange ; – l’identification rapide des constituants d’un mélange. L’observation de la plaque aux rayonnements ultraviolets (uv), généralement aux longueurs d’onde λ = 254 nm et λ = 354nm, suivie de sa révélation à l’aide d’un réactif approprié aide beaucoup à l’interprétation du chromatogramme obtenu.

Chromatographie en phase gazeuse (cpg)

Les principes décrits pour les deux types de chromatographie précédents demeurent valables pour le cas de la cpg. Elle est réservée à des constituants volatiles ou volatilisables par dérivation des composés relativement peu volatiles. On a à faire à une chromatographie gaz – solide. On l’utilise souvent dans l’analyse des composés volatiles. Elle permet, en effet, de bien séparer les différents constituants d’un mélange plus ou moins complexe, de les identifier (analyse qualitative) et d’en connaître leur teneur (analyse quantitative).  Lorsque l’échantillon à analyser est injecté, il subit une vaporisation dans la chambre d’injection. Ses constituants sont ensuite entraînés par le gaz vecteur vers la colonne où se produira la séparation. Ils sont plus ou moins longuement retenus par la phase stationnaire suivant leur masse molaire, leur volatilité et /ou leur degré de polarité (affinité). Cette fixation étant temporaire, au bout d’un certain temps les molécules sont entraînées par la phase mobile. Distance parcourue par la substance Rf = Distance parcourue par le front de l’éluant 26 Pour une colonne capillaire OV1, la phase stationnaire a la structure suivante : n H3C Si O CH 3 CH 3 Si CH 3 CH 3 O Si CH 3 CH 3 O CH 3 n H3C Si O CH 3 CH 3 Si O Si CH 3 CH 3 O CH 3 (a) (b) Figure 18 : Structures a) de diméthylpolysiloxane et b) de 5%-phényldiméthylsiloxane [13] La phase mobile est l’azote. Celui-ci est supposé neutre vis-à-vis des constituants du mélange. Remarque Pour les alcaloïdes des amphibiens On utilise couramment d’autres types de colonnes : 5%- phényl 95%-diméthylsiloxane et 5%-phényldiméthylsiloxane. A la sortie de la colonne se trouve un détecteur relié à un enregistreur. Le passage d’un constituant dans le détecteur entraîne une excitation électronique (courant électrique dans le cas d’un détecteur par ionisation de flamme – FID), ceci se traduit par un pic au niveau de l’enregistreur, dont l’aire est en corrélation avec la teneur massique du constituant considéré. On obtient pour l’ensemble des constituants un chromatogramme. Le nombre de pics recensés correspondra, en principe, au nombre de constituants présents dans l’échantillon dans le cas où la résolution de chromatogramme est bonne. 27 Le temps de rétention tR est la durée de séjour d’un constituant dans la colonne ; il s’agit d’un paramètre caractéristique de chaque constituant dans une phase stationnaire donnée, pour des conditions opératoires parfaitement définies. Le fonctionnement d’un chromatographe en phase gazeuse est représenté sur le schéma 2 Schéma 2 : Représentation schématique du fonctionnement d’un chromatographe en phase gazeuse. (HAMON M., PELLERIN F., GUERNET M., MAHUZIER G., Méthode de séparation Tome 2 : Méthodes spectrales et analyses organiques, Masson, Paris Milan, Barcelone, Mexico, (1990), p 208) 

Couplage cpg/spectrométrie de masse (cpg/sm)

Spectrométrie de masse

La sm est une technique de détermination de structure. Elle donne accès à la masse moléculaire d’un composé et aux divers fragments issus de l’ion moléculaire, lesquels permettent de remonter à la structure moléculaire initiale Les réactions de fragmentation se produisent à l’état gazeux. La base de la sm est la production d’ions positifs à partir d’une molécule neutre, détectés par le rapport m/z où m représente la masse de l’ion et z sa charge, généralement égale à +1. Deux principales techniques les plus utilisées en sm sont succinctement décrites. En ionisation chimique (ic) A la place d’un faisceau d’électrons, c’est un gaz réactif ionisé préalablement qui va réagir à son tour sur les molécules de l’échantillon provoquant ainsi l’ionisation de ce dernier. En général, on utilise comme gaz réactif (en anglais, reactant gas) le méthane, l’isobutane et l’ammoniac. Soient RH le gaz réactif et M l’échantillon : RH + ne RH + (n+1)e RH + M……..H……..R MH R + + + M Lors que l’affinité protonique de M (APM) est supérieure à celle de R. L’ionisation chimique requiert peu d’énergie et par conséquent, ne favorise pas une fragmentation importante. De ce fait elle donne des spectres plus simplifiés, comportant un pic important voisin d’une unité de masse du pic moléculaire, généralement formé par gain d’un ion hydrogène (M+H). En impact électronique (ie) L’ionisation est obtenue par bombardement de la molécule à l’aide d’un faisceau d’électrons : MNA+° est l’ion moléculaire. Il acquiert une énergie interne suffisante pour la fragmentation +° MNA MN + A MN + A + ° +° MNA MNA + 2e e +° 29 La procédure de dégradation peut se poursuivre si MN +° et MN+ ont encore une énergie interne suffisante [30, 31, 33, 34]. Note Les ions à nombre impair d’électrons ont une masse paire sauf s’ils contiennent un nombre impair d’azote. Au cours de l’ionisation par ie, il y a toujours formation d’ions négatifs, en faible quantité (< 4%), qui sont décelés en inversant la polarité des collecteurs. Ces ions peuvent aussi être utilisés pour suivre la fragmentation des molécules. Le couplage cpg/sm La cpg et la sm sont deux méthodes compatibles si un mélange séparé par cpg peut être analysé individuellement à l’aide de la sm. Le couplage cpg/sm en ic permet d’obtenir un chromatogramme avec les masses moléculaires. A partir de ce résultat, il est possible de faire une identification préliminaire du constituant. Le couplage cpg/sm en impact électronique fournit des données additionnelles, susceptibles de conduire à la structure : on cherche à élucider celle – ci en se basant sur les différentes fragmentations caractéristiques.