Dédoublement cinétique par hydrolyse enzymatique non conventionnelle de nouveaux substrats chiraux

Catalyse enzymatique et chimie verte

La chimie fait aujourd’hui partie de notre quotidien : c’est une industrie polluante à cause des déchets qu’elle fournit lors de fabrications des produits ou bien les réactifs toxiques utilisés dans les synthèses. Le concept de la chimie verte ou « Green Chemistry » 32 a été lancé aux États-Unis au début des années 1990 dans le but de réduire ou d’éliminer l’utilisation et la synthèse de substances dangereuses. Le concept est introduit par les chimistes américains Paul Anastas et John C. Warner en 1998 avec la mise en place de nouvelles pratiques pour la conception de produits et de processus chimiques basés le respect des 12 principes de la chimie verte conçus sur la durabilité et basés sur des ressources renouvelables et qui incluent les enzymes comme outils catalytiques. Les 12 principes de chimie verte : 1- Prévention : la haute sélectivité des enzymes permet de réduire les longs enchainements réactionnels de la synthèse organique classique, et conduit non seulement à l’amélioration des rendements des produits mais également de produire moins de déchets plutôt que d’investir dans l’assainissement ou dans leur élimination. 2- Economie d’atomes : la haute sélectivité des enzymes mène à concevoir les synthèses de manière à maximiser l’incorporation des réactifs de départ utilisés au cours du procédé dans le produit final. 3- Synthèses moins nocives : la biocatalyse permet de concevoir autant que possible des procédés de synthèse utilisant et créant des substances plus faiblement dangereuses pour les humains et sans conséquences sur l’environnement. 4- Conception de produits chimiques plus sûrs : les biocatalyseurs sont utilisés typiquement pour la synthèse et ils ne sont pas eux même des produits. 5- Réduction des Solvants et auxiliaires : les biocatalyseurs fonctionnent naturellement dans l’eau, à pH neutre, et à température ambiante. Ils sont fonctionnels également dans les solvants organiques ainsi qu’ils sont compatibles avec les liquides ioniques. 6- Minimiser les dépenses énergétiques : les biocatalyseurs accélèrent nettement les réactions, d’où le non nécessite du chauffage. Également, quelques biocatalyseurs sont compatibles avec les méthodes d’activation non conventionnelles, telle que l’utilisation des micro-ondes et des ultrasons qui permettent la réduction des dépenses énergétiques impactant l’économie et l’environnement. 7- Utilisation de matières premières renouvelables : généralement les biocatalyseurs sont issus des cultures cellulaires ou des micro-organismes entiers, et les matières premières pour ces cultures sont les sucres et les acides aminés qui sont renouvelables. 8- Réduction de la quantité de produits dérivés : la haute sélectivité des biocatalyseurs permet d’éliminer toute dérivation de synthèse organique appelant toujours à plusieurs étapes de protection/déprotection. 9- Catalyse : pilier de la chimie verte du fait de l’efficacité supérieure des biocatalyseurs, où chaque molécule d’enzyme possède le pouvoir de convertir des milles à des millions de substrats en produits, en un temps modéré (TON très élevé). 10- Conception de substances non-persistantes : les biocatalyseurs sont parfaitement biodégradables. 11- Analyse en temps réel de la lutte contre la pollution : pas de spécial avantage pour les biocatalyseurs. Les réactions biocatalysées sont contrôlées en temps réel par la mesure du pH, etc.… 12- Chimie essentiellement sécuritaire afin de prévenir les accidents : Les réactions biocatalysées se déroulent généralement sous des conditions douces, pH, températures ambiantes et pression atmosphériques, d’où l’absence de tout risque d’accidents. On constate que les processus biocatalytiques sont fortement alignés avec ces 12 principes et cela a contribué au développement de la catalyse enzymatique. L’emploi de biocatalyseurs permet de répondre beaucoup plus adéquatement aux principes de chimie verte, c’est une alternative viable à la chimie classique qui emploi des complexes organiques, métalliques dans les protocoles de synthèse industrielle. De nombreux procédés ont été modifiés et adaptés afin de respecter ces principes de chimie verte et l’exemple de la synthèse de l’ibuprofène est particulièrement représentatif. L’ancien procédé de synthèse de cet anti-inflammatoire non stéroïdien connu depuis les années 1960 est le procédé de Boots. 34 Cette synthèse se déroule en six étapes et génère des quantités très importantes de déchets qu’il faut séparer et éliminer, la production annuelle de 13000 tonnes d’ibuprofène génère plus de 20000 tonnes de déchets. Au début des années 1990, la société BHC a développé et a mis en exploitation industrielle un procédé catalytique en trois étapes (Schéma 13) qui génère une quantité beaucoup plus faible de produits secondaires. Ces sous-produits sont par ailleurs récupérés et valorisés, ce processus ne génère finalement pas de déchets. Schéma 13 : Procédure catalytique pour la production de l’Ibuprofène. Par ailleurs, c’est l’activité biologique de l’énantiomère (S)-ibuprofène qui est la plus importante et depuis plusieurs années les travaux de recherche sont axés sur l’obtention de l’énantiomère (S) : soit par hydrolyse des esters correspondants ou par alcoolyse de l’acide racémique. C’est la voie biocatalytique qui est privilégiée avec l’utilisation de la forme immobilisée de la lipase de Candida rugosa (CRL), lors de l’alcoolyse de l’acide par le 1- butanol, le (S)-ester est obtenu avec un ee = 83%. 35 (Schéma 14) Schéma 14 : Alcoolyse lipasique de l’ibuprofène. La catalyse, pilier fondamental de la chimie verte est un axe majeur de recherche et de développement industriel. C’est une approche clé pour fournir des solutions réalistes à de nombreux problèmes environnementaux.  Un catalyseur est une substance minérale ou organique qui participe à une réaction en favorisant chimiquement la formation  d’intermédiaires réactionnels, ou physiquement en permettant de meilleurs contacts entre les réactants, ce qui fait que sa présence diminue l’énergie d’activation nécessaire pour effectuer une réaction en son absence, augmentant ainsi la vitesse de cette dernière. (Figure 9) Figure 9 : Diagramme énergétique d’une réaction catalytique. Un catalyseur a la propriété d’être sélectif et favorise la formation du produit recherché, dans certains cas il peut être récupérable et réutilisable. Il tâche d’optimiser d’autres facteurs tels que le rendement réactionnel, la stabilité, la solubilité, et la facilité de la séparation du produit synthétisé.

La catalyse enzymatique

La catalyse enzymatique ou « Biocatalyse », consiste en l’utilisation de catalyseurs naturels que sont les enzymes afin de réaliser des transformations chimiques sur des composés organiques. Cette technologie est reconnue en 1833 par la découverte de l’α-amylase ou « la diastase », qui était capable d’hydrolyser l’amidon et d’en séparer le sucre soluble. 38 Les biotechnologies connaissent une grande importance dans le domaine de la fabrication des produits pharmaceutiques et/ou des produits chimiques (parfums, produits alimentaires) et des polymères. 39 Une alternative avantageuse est utilisation des biocatalyseurs pour la synthèse des molécules chirales en raison de la régio- et la stéréo-sélectivité que ce soit dans les solvants organiques ou dans les milieux aqueux.  Un exemple intéressant est la synthèse chimique conventionnelle de la Sitaglipitin (le composé actif du médicament antidiabétique Januvia™), implique l’hydrogénation asymétrique de la Prositagliptin à haute pression avec un catalyseur à base de rhodium, suivie d’un traitement spécial pour éliminer le rhodium et une étape de cristallisation pour isoler le produit souhaité (Schéma 15). Bien qu’elle soit énantiosélective, cette voie chimiocatalytique est coûteuse en raison de la nécessité de récipients à haute pression spécialisés, ainsi les étapes difficiles de traitement. Ces limites sont contournées par le développement d’une voie biocatalytique en employant un biocatalyseur transaminase, ce qui permet une efficacité de synthèse de la Sitaglipitin avec une amélioration du rendement en une seule étape. 40 Schéma 15 : Comparaison entre chimio-catalyse et biocatalyse pour la synthèse de la Sitagliptin. 

Définition et structure des enzymes

Les enzymes sont des enchaînements d’acides α-aminés de nature protéique ayant une propriété catalytique ; ses protéines ont une masse molaire élevée, supérieure à 10 000  daltons. 41 Cette nature protéinique présente un maximum de quatre niveaux d’organisation structurale. 42 (Tableau 2) Tableau 2 : Structures des enzymes. Structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire de l’enzyme Remarques La structure primaire présente la première séquence des aminoacides sous sa forme linaire ; Le premier repliement par des liaisons d’hydrogène à intervalle régulier en hélice α et en feuillet β amène à la structure secondaire des enzymes ; Après un deuxième repliement par des liaisons diverses à intervalle irrégulier la formation d’une chaine polypeptidique donne naissance à la structure tertiaire ; Une dernière forme plus volumineuse est la structure quaternaire qui se forme après la combinaison de plusieurs chaînes polypeptidiques. 

Avantages et inconvénients des enzymes

La résolution enzymatique est une technique simple, verte, hautement sélective qui permet d’aboutir aux deux énantiomères parfaitement séparés. 43 L’utilisation d’enzymes en synthèse comporte plusieurs avantages intéressants par rapport aux réactifs chimiques usuels. Les enzymes sont des catalyseurs qui peuvent être utilisés pour la majorité des réactions connues en chimie organique, ils ont une très haute sélectivité :  énantiosélectivité  (Schéma 16), ces sélectivités peuvent varier d’un substrat à l’autre mais restent souvent très élevées et cet avantage explique leur grande utilisation en synthèse. Schéma 16 : Sélectivités des enzymes. Les enzymes catalysent des réactions dans différents milieux : en synthèse, il est évidemment possible de les employer en milieu aqueux qui est le milieu naturel des enzymes, la combinaison de transformations biocatalytiques et chimio-catalytiques vers des processus one-pot en milieu aqueux présente un domaine de recherche attractif d’un point de vue académique ou industriel. D’autre part, les enzymes sont couramment utilisées dans les solvants organiques, ce qui augmente la solubilité des composés organiques et qui a permis le développement de la catalyse enzymatique en chimie organique 46 et cela présente de nombreux avantages : Stabilité essentiellement dans les solvants organiques peu polaires tels les solvants aromatiques, les solvants chlorés, les alcanes et les éthers. L’enzyme est facilement éliminée et récupérer par une simple filtration. Augmentation de la sélectivité.  La majorité des procédés synthétiques nécessitent de hautes pressions, des températures élevées et des solvants organiques, les enzymes, elles, se démarquent par les excellentes sélectivités et les hautes efficacités, elles permettent de réagir dans des conditions douces. Elles sont habituellement utilisées à température ambiante pour éviter la dénaturation de l’enzyme, à pression atmosphérique, et dans des solutions aqueuses proches des pH neutres. Les enzymes sont généralement peu toxiques et biodégradables, elles peuvent être réutilisables et n’apportent aucun risque à l’environnement. Ces biocatalyseurs possèdent toutefois quelques inconvénients, ils sont parfois difficiles à se procurer commercialement, leur coût est élevé et ils n’existent que sous une forme chiral unique. Par ailleurs, leur mode d’isolement et leur pureté font généralement varier leur activité. Leur utilisation reste limitée à cause de leur fragilité et leur sensibilité, ils peuvent se dénature dans certaines conditions opératoires (température, pH) et l’utilisation de solvants polaires peuvent limiter la possibilité d’employer une enzyme donnée. Les hydrolases sont les enzymes les plus faciles à utiliser car elles ne nécessitent pas de coenzyme pour leur utilisation contrairement aux autres enzymes qui sont inactives sans coenzymes. Par ailleurs, ces cofacteurs sont onéreux et leur solubilité est limitée dans les solvants organiques. 

Fonctionnement des enzymes

Les enzymes comportent « un site actif » ; il s’agit généralement d’une petite zone de l’enzyme qui prend en charge le substrat (Figure 10). Ce site a deux sous-parties :  Site de fixation : il permet la stabilité du substrat dans le site actif en mettant face à face la partie de la molécule de substrat qui devra est transformée, avec les acides aminés. Lorsque le substrat est fixé au sein du site de fixation, un complexe enzymesubstrat (ES) se forme grâce à des liaisons faibles.  Site catalytique : un ensemble d’acides aminés interagirent directement avec le substrat qui pourra ensuite facilement évoluer vers la formation de produit. Figure 10 : Mécanisme catalytique des enzymes. L’interaction entre le substrat et l’enzyme s’explique par deux modèles 47 (Figure 11) :  Modèle clé-serrure (Fisher 1890) : le substrat se fixe directement dans le site actif de l’enzyme comme une clé s’adapte à une serrure.  Modèle de l’ajustement induit (Koshland 1958) : comme l’enzyme à une structure flexible ; le substrat se fixe après un changement conformationnel du site actif de l’enzyme. Figure 11 : Modèle des interactions enzyme-substrat. Cette complémentarité enzyme-substrat explique la haute spécificité enzymatique envers un seul type de réaction pour un substrat défini, ce qui confère aux enzymes une grande spécificité. 

Cinétique enzymatique

En catalyse enzymatique, la vitesse initiale (v0) croît avec la concentration initiale en substrat [S]0 jusqu’à un maximum (vmax). Le mécanisme réactionnel de type « Michaelis-Menten » suppose que dans la majorité des réactions enzymatiques, les réactifs constituant un substrat noté (S) d’une réaction biologique catalysée par une enzyme notée (E) donnent des produits (P) en passant par la formation d’un intermédiaire [enzyme-substrat] [ES]. Ce complexe peut  tout aussi bien redonner le substrat et l’enzyme, que produire l’enzyme et les produits comme il est montré dans l’équation ci-dessous : Schéma 17 : Réaction enzymatique. k+1 et k-1 : Constantes de vitesses de la réaction de formation du complexe enzyme-substrat qui est un équilibre rapide. kcat: Constante de vitesse de l’étape limitant ; c’est la constante de vitesse de l’enzyme. La vitesse de la réaction est déterminée en fonction de vitesses de formation des deux énantiomères (R et S) du substrat.      m cat cat k k E S v  k E.S  Equation.1. km est la constante de Michaelis qui détermine l’affinité de l’enzyme pour le substrat. Le rapport (kcat/ km) caractérise l’affinité spécifique d’une enzyme pour son substrat. 1 1     k k k k cat m Equation.2.