Discreet structural and functional differences between the membrane forms of human IgA1 and IgA2

La survie et la fonction des lymphocytes B requièrent l’expression d’immunoglobulines (Ig) sous la forme du récepteur membranaire B (BCR), qui transmet par lui même un signal de survie tonique et favorise également l’activation cellulaire lors de la liaison spécifique à un antigène permettant ainsi l’initiation des réponses humorales. La transduction du signal est fournie par les parties intracytoplasmiques des CD79a et CD79b qui possèdent des motifs ITAM (motif d’activation à base de tyrosine d’immunorécepteur). La phosphorylation d’ITAM par les kinases associées au BCR après l’activation du BCR induit la cascade de signalisation dans les lymphocytes B. Il existe de multiples indications selon lesquelles ce signal varie entre les formes membranaires des différentes classes d’Ig. Parmi les cinq classes d’Ig humaines, l’IgA est l’isotype le plus abondant au niveau des muqueuses et il est divisé en deux sous-classes d’IgA: IgA1 prédominantes et IgA2, qui diffèrent dans leur structure et leur distribution dans l’organisme. Afin de vérifier les différences entre ces deux populations de cellules B, nous avons exploré différents paramètres parmi les lymphocytes B circulants humains produisant des IgA et en comparant deux modèles de knock-in spécifiques de souris mis au point pour favoriser l’expression d’IgA1 ou IgA2 humaines sur les lymphocytes B de souris. Ces modèles ont été obtenus en introduisant l’un des gènes humains α à la place de la région switch endogène µ (Sµ) dans le locus IgH. Des différences frappantes apparaissent dans ces modèles où l’IgA2 s’est révélée beaucoup moins efficace que l’IgA1 pour soutenir la survie des cellules B, permettant alors seulement la production d’IgA2 dans les cellules B produisant en plus un BCR de substitution (ce que nous avons réalisé par l’expression de la protéine virale LMP2A). Découvrant une faible production d’IgA2 chez les souris hétérozygotes pour le knock-in du gène C2, et son absence totale chez les animaux homozygotes, nous nous sommes demandés si l’α2 HC humain s’assemblait correctement avec la chaîne légère ? Nous avons croisé des souris hétérozygotes avec les «souris knock-in Kappa Switch» qui expriment une chaîne légère fonctionnelle d’immunoglobuline humaine (hLC afin obtenir une IgA dont les régions constantes soient entièrement humaines (notamment CH1 et C qui doivent s’apparier). Les souris α2KI / + KIKS / KIKS ont montré une population de B accrue par rapport aux souris α2KI homozygotes. De plus, ces souris ont présenté une augmentation significative de la synthèse plasmatique d’IgA2. Plus tard, nous voulions améliorer la production d’IgA2. Nous avons donc essayé d’améliorer le développement des cellules B chez les souris α2KI / + en croisant des souris hétérozygotes avec des souris DHLMP2A-KI, où la protéine LMP2A du virus d’Epstein-Barr est connue pour son rôle de soutien du développement lymphocytaire B et différenciation des cellules plasmocytaires. Dans ces conditions double-hétérozygotes, les signaux de survie donnés par LMP2A exprimé par un allèle IgH permettent une maturation B…, et un peu d’expression d’IgA2 humaine via le second allèle IgH 2KI. Malgré tout, ces conditions d’expression d’un BCR IgA « passager », n’ont pas permis de produire d’IgA2 spécifiques en réponse à une immunisation, et ce modèle garde des limitations intrinsèques, même si un petit contingent d’IgA2 circulantes est finalement obtenu. Enfin, l’exploration du modèle de souris α2KI a permis d’identifier des différences fonctionnelles entre les sous-classes d’IgA1 et d’IgA2 humaines. Ce modèle peut être utile pour l’étude et la compréhension des mécanismes des maladies liées aux dépôts passifs d’IgA, qui impliquent en règle chez l’homme des IgA1.

Introduction

B-lymphocytes express several types of receptors on their cell surface including the B cell receptor or BCR. This receptor is composed of an immunoglobulin associated with the disulfide-linked Igα/Igβ (or CD79a/CD79b) heterodimer complex. Signal transduction is provided by the intracytoplasmic parts of the CD79a and CD79b which possess ITAM motifs (immunoreceptor tyrosine-based activation motif). ITAM phosphorylation by BCR-associated kinases after BCR activation induces the signaling cascade within the B lymphocytes (Reth and Wienands, 1997). In humans, there are five classes of immunoglobulins: IgM, IgD, IgG, IgE and IgA. IgA is the main immunoglobulin produced in the mucosa constituting a first line of defense against infectious agents and toxins that invade the organism (Brandtzaeg, 2007). Monomeric, dimeric and polymeric forms of IgA have been identified. These forms are responsible for different functions during the immune response (Woof and Kerr, 2006). Two IgA subclasses are present in humans: IgA1 and IgA2. Circulating IgA only includes IgA1 whereas in the mucosa IgA1 and IgA2 coexist. The main structural difference between IgA1 and IgA2 is the absence of an 18 amino acid sequence in the IgA2 hinge region (compared to IgA1) (Woof and Kerr, 2004). The hinge region of IgA1 contains three to five O-linked carbohydrates which are absent in IgA2 (Rifai et al., 2000a). IgM-to-IgA switch is regulated by multiple cytokines (such as TGF-β and IL-10) and by interaction with T cells (Cerutti, 2008; Defrance et al., 1992). As previously reported, Sµ replacement by the human α1 gene (α1KI mice) showed a supportive role for humoral immune responses albeit a reduced number of B lymphocytes. Data also showed that IgA1 promotes activation and differentiation of plasma cells (Duchez et al., 2010a). To date, little is known about the role of IgA2 in conferring specific features to mIgA2+ cells compared to mIgM+ and mIgA1+ cells. In this study, we checked whether, similarly to α1 HC, α2 HC substitution supported lymphopoiesis and modified B cell fate. For this purpose, we generated α2KI mice by knocking-in the human Cα2 gene downstream of JH (joining gene).

Generation of α2KI mice

α2KI mice were generated using the targeting strategy depicted in Figure 1 and primers are listed in Table 1. The secreted and membrane forms of the human α2 HC coding genes were inserted in place of the Sµ gene. The NeoR cassette inserted downstream of the α2 gene and flanked by loxP sites was removed by mating α2KI mice with EIIa Cre transgenic mice. 

Abnormal B cell development in α2KI mice

To test α2 HC expression in mutant mice, flow cytometry analysis was conducted on bone marrow and spleen lymphocytes. Results showed that in homozygous α2KI mice, the percentage of bone marrow B cell was severely decreased whereas it remained normal in heterozygous mice compared to WT. In addition, an expansion in relative percentage of proB/preB cells was observed while immature B cells were largely reduced in number. This can indicate a blockade at the proB/preB to immature B cell transition. Surprisingly, B220+ cells were barely detected in the spleen showing a 16-fold decrease in percentage in homozygous mice but only 2-fold decrease in α2KI/+ mice. This reduction similarly affected the transitional, follicular and marginal zone B compartments. Consistent with the abolishment of B cell compartments, circulating hIgA2 was barely detectable in α2KI/+ mice serum but totally absent in α2KI homozygous mice (data not shown). Due to this low IgA2 production in heterozygous mice and its total absence in homozygous animals, we wondered whether the human α2 HC did not assemble correctly with the murine light chain and consequently BCR density and functionality were affected. We crossed heterozygous mice with the “knock-In Kappa Switch mice” which expresses a functional human A. WT locus VH1 VH2 VH3 VHn DH1 DH2 DHn JH1JH2 JH3 JHn Eµ Sµ Cµ Cδ Sγ3 Cγ3 Sγ1 Cγ1 Sγ2b Cγ2b Sγ2a Cγ2a Sɛ Cɛ Sα Cα B. Targeting construct Eµ Cµ Neo cassette C. After VDJ rearrangement Human α2 gene VHDJH Eµ Cµ Floxed Neo Knock­in human α2 gene CH1 CH2 CH3 mb loxP loxP StuI SpeI XhoI immunoglobulin light chain (hLC) to obtain a fully human IgA. Interestingly, α2KI/+ KIKS/KIKS mice had increased spleen B populations compared to homozygous α2KI mice. In addition, these mice showed a significant increase in plasma IgA2 synthesis. Later, we wished to ameliorate IgA2 production, so we tried to improve B cell development in α2KI/+ mice by crossing heterozygous mice with DHLMP2AKI mice, where the Epstein-Barr virus LMP2A protein, as a constitutively active BCR, is known to drive B cell development and plasma cell differentiation as previously described (Casola et al., 2004a). As a result for LMP2A survival signals on B cells, progenitor B cells can differentiate into mature B cells (Table 1)

Immunoglobulins production by α2KI mice

Concerning endogenous Ig production, similarly to α1KI mice, homozygous α2KI lacked IgM production as a consequence of Sµ replacement with hα chains, whereas normally plasma IgM levels were detected in heterozygous mice (300-400 μg/mL) (Figure 2A). Excepted for the homozygous α2KI mice, murine IgG and IgA secretion was not abolished in all αKI mice (Figure 2B and 2C). Neither homozygous α2KI/α2KI nor α2KI/+ KIKS/KIKS mice produced human IgA2. In contrast, hIgA2 levels successfully increased about 45x in heterozygous α2KI/+ crossed with DHLMP2AKI mice in comparison with the α2KI mice with a mean titer of 28 μg/mL (Figure 2D).