Les marqueurs moléculaires
Les fragments d’ADN
Les marqueurs moléculaires sont des séquences nucléotidiques qui permettent de détecter des polymorphismes de l’ADN et sont donc qualifiés de mesures directes de la diversité. Il existe plusieurs types de marqueurs moléculaires, classés selon différents critères. Il existe une classification de ces marqueurs basée sur le type de polymorphisme détecté (polymorphisme de séquence, polymorphisme du nombre d’unités de répétition, polymorphisme d’insertion-délétion). Il existe un autre type de classification des marqueurs tels que : les marqueurs co-dominants, c’est-à dire qui différencient les individus hétérozygotes des individus homozygotes, et les marqueurs dominants qui révèlent en masse. Parmi les marqueurs moléculaires il y a :
Les marqueurs RFLP (Restriction fragment Length Polymorphism) : Le polymorphisme est révélé grâce à des enzymes de restriction qui coupent au niveau de leurs sites de restriction. Ils sont classés dans la catégorie des marqueurs codominants révélés individuellement et dans les marqueurs à polymorphisme de séquence (Sezonlin, 2006).
Les marqueurs AFLP (amplified fragment-length polymorphism) : Il s’agit d’utiliser deux enzymes de restriction l’un coupant plus fréquemment que l’autre et des adaptateurs pour l’amplification. Ce polymorphisme est un polymorphisme de longueurs de fragments amplifiés. Ce sont des marqueurs dominants révélés en masse et des marqueurs à polymorphisme de séquence (Vos et al., 1995).
Les marqueurs ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) : Il s’agit d’un polymorphisme de longueur de fragments amplifiés. Ce sont des marqueurs dominants révélés en masse et des marqueurs à polymorphisme d’unités de répétition. Sa technique consiste à utiliser des microsatellites comme amorces et d’amplifier les séquences entre eux.
Les marqueurs microsatellites ou SSR (Simple Sequence Repeat), sont des séquences répétées en tandem de 2 à 6 nucléotides. Ils sont révélés après leur amplification grâce à des amorces spécifiques aux régions flanquantes conservées. Ainsi ce polymorphisme est celui d’unités de répétition. Ce sont des marqueurs codominants, révélés individuellement. Ils sont répartis sur l’ensemble du génome (Selkoe & Toonen, 2006). Ce sont les marqueurs les plus fréquemment utilisés pour l’étude de diversité génétique car ils sont reproductibles, co-dominants, très polymorphes, bien repartis dans le génome. Tous ces caractères font d’eux, un excellent outil pour des études de diversité génétique (Wong et al., 2004).
Les séquences nucléotidiques
L’ADN nucléaire : Les régions codantes du génome nucléaire comportent des gènes qui sont exprimés et dont les produits donnent des ARN ribosomiques ou des chaînes polypeptidiques. Beaucoup de gènes nucléaires sont en copies multiples rendant difficile leur utilisation dans les études moléculaires (Goldstein et al., 1995). La phylogénie d’un gène représente de façon certaine l’histoire généalogique particulière de ce dernier. Celle-ci peut différer entre les différents gènes de l’espèce étant donné qu’ils ne sont pas toujours génétiquement liés entre eux et que les effets d’autres forces évolutives, comme la dérive génétique et la sélection naturelle, seront différents d’un gène à un autre. Pour cette raison, plusieurs gènes non liés doivent être utilisés pour la reconstruction phylogénétique. De plus, la constatation que l’arbre de gènes mitochondriaux peut représenter seulement un volet, parfois, partiellement biaisé (par les contraintes évolutives ou par les méthodes des reconstructions phylogénétiques) de l’histoire phylogénétique des organismes a conduit les systématiciens molécularistes de s’orienter vers des marqueurs nucléaires pour compléter les données mitochondriales (Sezonlin 2006). Quelques gènes nucléaires ont été utilisés pour la phylogénie des arthropodes (Friedlander et al., 1992). Marqueurs d’ADN mitochondrial : L’ADN mitochondrial (ADNmt) est une petite molécule circulaire (15-20 kb), composée d’environ 37 gènes codant pour 22 ARNt, 2 ARNr et 13 ARNm, ces derniers codant pour des protéines impliquées principalement dans le transport des électrons et la phosphorylation oxydative des mitochondries.
L’ADN mitochondrial est hérité de la mère dans la plupart des espèces (à l’exception de fuites paternelles y compris les souris (Gyllesten et al., 1991); héritage biparentale dans les moules marines (Zouros et al., 1992). L’ADN mitochondrial ne se recombine pas (Hayashi et al., 1985), bien que certains éléments de preuve d’événements de recombinaison ont été
récemment rapportés (Eyre-Walker et al., 1999 ; Hagelberg et al., 1999). Les individus sont généralement homoplasmiques pour un haplotype mitochondrial mais aussi des conditions hétéroplasmiques ont été signalées dans de nombreuses espèces, par exemple chez des chauves-souris (Wilkinson et Chapman, 1991) et chez la Drosophile (Volz-Lingenhohl et al., 1992).
Comme un marqueur moléculaire, l’ADN mitochondrial présente de nombreux avantages. Il évolue plus vite que l’ADN nucléaire (Brown et al., 1982), probablement en raison de la réparation des erreurs de réplication inefficace (Clayton, 1984). Il est utilisé pour révéler les clusters géographiques de molécules apparentées (particuliers) ou des relations matrilinéaires au sein des populations. Il peut également être utilisé pour retracer les événements historiques tels que les goulots d’étranglement, ou pour détecter l’hybridation entre les espèces et les sous espèces d’animaux d’élevage (Nijman et al., 2003). L’ADNmt peut aussi être très utile pour résoudre les relations phylogénétiques entre taxons étroitement liés (Moritz et al., 1987). Il est haploïde et retrace la lignée maternelle chez les vertébrés (Breton et al.,2007). D’autre part, son taux de substitutions est supérieur à celui des séquences nucléaires (exceptés les microsatellites), par conséquent la monophylie peut être atteinte plus rapidement, et le diagnostic de l’isolement reproductif plus précoce (Brown et al.,1982 ; Barallon, 2008).
L’ADN mitochondrial (ADNmt) a été largement utilisé lors des analyses de la diversité phylogénétique et génétique. L’ADNmt, haploïde et transporté par les mitochondries du cytoplasme cellulaire, possède un mode maternel d’hérédité (les animaux héritent l’ADNmt de leurs mères et non de leurs pères) et un taux de mutation élevé; il ne se recombine pas. Ces caractéristiques consentent aux biologistes de reconstruire les relations évolutionnaires intra et interraciales par l’évaluation des modèles de mutation de l’ADNmt. Les marqueurs d’ADNmt peuvent également fournir un moyen rapide de détecter l’hybridation entre les espèces et les sous-espèces d’animaux (Nijman et al., 2003).
Le mil
Le terme « mil » regroupe plusieurs genres de plantes appartenant à la famille des Poaceae, anciennement connues sous le nom de Graminées, de l’ordre des Cyperales, de la classe des Liliopsida, de la division des Magnoliophyta, du règne des Plantae. Dans cette famille nous pouvons citer les genres Eleusine, Pennisetum, Setaria et Panicum.
Le genre Pennisetum communément appelé mil pénicillaire ou mil à chandelle est caractérisé par un épi compact d’une longueur variant de 10 à 150 cm. C’est le mil le plus cultivé à travers le monde et peut pousser dans des sols sableux et pauvres. Très adapté aux conditions de sécheresse, son potentiel de rendement est le plus élevé de tous les mils cultivés en température élevée ou en condition de sécheresse (Bezançon et al., 1997). Ceci est dû au fait qu’il a la capacité de mettre en place des mécanismes physiologiques favorisant la tolérance à la sécheresse comme le ralentissement des pertes en eau au niveau des feuilles supérieures, via une régulation de l’évapotranspiration, assurant le maintien d’un niveau hydrique favorable (Winkel et al., 1997). Il est constitué d’une soixantaine d’espèces qui sont distribuées dans les régions tropicales et subtropicales (Bezançon et al., 1997) dont Pennisetum glaucum.
Importance du mil
Le mil est la base de l’alimentation quotidienne des 50 millions d’habitants du Sahel. Extrêmement résistant à la sécheresse et bien adapté aux sols pauvres, il reste la seule culture correspondant véritablement aux conditions du milieu et aux habitudes alimentaires traditionnelles (Actualité scientifique, 2009). De plus le mil est cultivé soit en culture pure continue dans les champs de case ou en rotation avec l’arachide dans les champs de brousse, soit en culture associée avec le niébé dans le centre-nord (BRAAS, 2005).
C’est le grain, d’une valeur nutritionnelle supérieure à celle du riz et du blé, qui constitue le principal produit de la culture (Andrews et Kumar, 1992). Il représente souvent la base de l’alimentation et se consomme alors sous la forme de pâte, de bouillie, de couscous ou de galettes. Il peut également entrer dans la fabrication de boissons alcoolisées comme la bière de mil. (Bezançon et al.,1997).
Présentation de l’Insecte : Tribolium castaneum (Herbst, 1797)
Position systématique: T. castaneum (Herbst, 1797) présente la position systématique suivante : Règne : Animale, Embranchement : Arthropode, Classe : Insecte, Ordre : Coleoptere, Famille : Tenebrionidae Genre : Tribolium, Espèce : castaneum.
Origine et répartition géographique : Provenance très mal connu, son pays d’origine est à chercher vraisemblablement dans les contrées orientales. Répandu aujourd’hui presque dans le monde entier, T. castaneum pourrait être originaire d’Asie du sud (Delobel & Tran, 1993). Etant donné sa sensibilité au froid, une véritable hibernation ne devrait être possible que dans des provisions ayant une température constante supérieure à 10°C (Camara, 2009). Du fait de leur adaptabilité, les insectes comme T. castaneum font partie dans tous les pays européens, des insectes dits en quarantaine, c’est-à-dire des insectes dont il faut à tout prix éviter l’importation (Erwin et al., 1993). C’est un insecte cosmopolite, qui affectionne les farines dans lesquelles il creuse des galeries. De plus, cet insecte a des glandes odoriférantes qui sécrètent un liquide nauséabond et donnent une odeur désagréable aux denrées alimentaires qu’ils infestent (Pageau, 2006).
Morphologie de l’insecte : C’est un insecte appartenant à la famille des Ténébrionidae. L’adulte mesure de 3 à 4mm, de couleur uniformément brun rougeâtre. Il est étroit, allongé, à bord parallèle, à pronotum presque aussi large que les élytres et non rebordé antérieurement. Les 3 derniers articles des antennes sont nettement plus gros que les suivants. Contrairement à T. confùsum, le chaperon ne dépasse pas l’œil latéralement. La larve mesure 6mm, environ 8 fois plus longue que large, d’un jaune très pâle à maturité, avec latéralement quelques courtes soies jaunes. La capsule céphalique et la face dorsale sont légèrement rougeâtres (Camara, 2009). En outre le quatrième segment des antennes de T.castaneum est réduit par rapport aux trois premiers alors que chez T. confusum les quatre premiers segments sont de même taille.
Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. Les différents types de marqueurs
I.1.1. Les marqueurs moléculaires
I.1.1.1. Les fragments d’ADN
I.1.1.2. Les séquences nucléotidiques
I.2. Le mil et son importance
I.2.1. Le mil
I.2.2. Importance du mil
I.3. Présentation de l’Insecte : Tribolium castaneum (Herbst, 1797)
I.3.1. Origine et répartition géographique
I.3.2. Morphologie de l’insecte
I.3.3. Bio-écologie
I.3.4. Type de dégâts et importance
I.3.5. Lutte
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
II.1. Echantillonnage
II.2. Etude génétique
II.2.1 L’intérêt du Cytochrome b
II .2.2. Extraction de l’ADN de Tribolium castaneum
II.2.3. Polymérase Chain Réaction (PCR) du gène cytochrome B
II.2.4. Séquençage du Cytochrome b
II.3. Analyses génétiques
II.3.1. Analyse du polymorphisme et de la variabilité génétique de la population de T.castaneum
II.3.3. Reconstructions phylogénitique des haplotypes
CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION
III.1. Présentation des résultats
III.1.1. Polymorphisme et variabilité génétique de la population de T. castaneum
III.1.2. Identification des Haplotypes
III.1.2.2. Composition en acides aminés
III.1.2.3. Distances génétiques entre les haplotypes
III.1.4. Réseau minimum d’haplotypes
III.1.5. Les arbres phylogénétiques des haplotypes
III.1.3.1 Distribution des haplotypes selon les localités
III.1.3.2 Distribution des haplotypes selon les zones agroécologiques
III.2. Discussion
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
