Impact de Sporobolus robustus Kunth sur la microflore symbiotique

La rhizosphère et sa communauté microbienne

 Le système racinaire d’une plante est la partie souterraine lui servant à l’ancrage au sol, à l’absorption de l’eau et des minéraux, au stockage de ses réserves et à sa propagation ou dispersion. Le système racinaire a également comme rôle la synthèse de composés impliqués dans la régulation de sa croissance et celle des organismes qui l’entourent (Bertin et al., 2003). Les racines ne peuvent être étudiées et comprises dans toute leur complexité sans considérer également leur environnement immédiat. C’est Lorenz Hiltner qui utilisa le premier en 1904, le terme de rhizosphère, provenant du grec « rhiza » signifiant racine et« sphere/sphaera » signifiant cercle d’influence. La rhizosphère représente donc le champ d’influence du système racinaire, et comprend l’ensemble des racines ainsi que la zone de sol proche influencée par les racines. La rhizosphère comprend trois parties : la rhizosphère sensu stricto, le rhizoplan et la rhizosphère interne (Figure 1). La rhizosphère sensu stricto est constituée du sol entourant la racine, dans lequel diffusent les exsudats et se décomposent les lysats racinaires. Le rhizoplan représente la surface des racines et le mucigel tandis que la rhizosphère interne est constituée du cortex racinaire colonisé par de nombreux microorganismes qui forment un grand réservoir de diversité biologique. Cependant, il y a plus de microorganismes en nombre et espèces dans la rhizosphère sensu stricto que dans les deux autres régions de la rhizosphère (Badri et al., 2009). L’ensemble des micro-organismes de la rhizosphère représente le microbiote rhizosphérique (Chapelle et al., 2015). Les caractéristiques biologiques et physico-chimiques de la rhizosphère dépendent en grande partie de la nature des composés exsudés par la plante dans un processus appelé rhizodéposition. La quantité et la composition de ces composés sont fortement influencées par les facteurs suivants : l’espèce végétale, le stade de développement de la plante et sa nutrition, le type de sol, les conditions de l’environnement telles que la température, le potentiel hydrique du sol et l’intensité de la lumière. Grâce à la rhizodéposition, de nombreuses molécules solubles, insolubles ou gazeuses sont disponibles au niveau des racines. Toute une myriade de composés carbonés issus de la photosynthèse, des ions inorganiques, de l’eau et des protons s’accumulent dans la rhizosphère (Bertin et al., 2003). Les composés carbonés C Chapitre 1. Revue bibliographique 6 exsudés par la plante sont fortement majoritaires et peuvent représenter entre 5 et 20% des photosynthétats produits par celle-ci. Figure 1. La rhizosphère. Figure 2. Représentation de la diversité des interactions entre les racines des plantes et les microorganismes du sol. La diversité des molécules chimiques impliquées dans les mécanismes de signalisation entre la plante hôte et les autres organismes de la rhizosphère est indiquée par des flèches. La reconnaissance de ces signaux amènera à la mise en place d’une association parasitique ou mutualiste. D’après Hirsch et al., 2003. Les exsudats racinaires sont une source d’énergie et de signaux qui vont déterminer la diversité, la densité et l’activité des organismes présents dans la rhizosphère. Il a été en effet observé une grande variabilité des communautés microbiennes dans la rhizosphère selon les espèces de plantes. Les microorganismes du sol vont établir des relations directes ou indirectes avec celles-ci (Figure 2). Dans la plupart des cas, les relations entre une plante hôte et un microorganisme du sol sont précédées par la reconnaissance des partenaires des signaux chimiques (Hirsch et al., 2003). Dans le cas des microorganismes symbiotiques, les légumineuses sont connues pour exsuder des flavonoïdes qui attirent les rhizobia. Dans le cas des mycorhizes, la plante exsude également des flavonoïdes qui stimulent la ramification des hyphes du champignon. Ces relations plante-microorganisme sont mutuellement bénéfiques aux deux partenaires. La symbiose végétale la plus ancienne et la plus répandue dans la nature est la symbiose mycorhizienne à arbuscules. La symbiose végétale la plus connue associe les plantes de la famille des Fabaceae et des bactéries fixatrices d’azote encore appelées rhizobia au sens large. 

La symbiose fixatrice d’azote légumineuse-rhizobium 

Généralités sur la fixation biologique de l’azote

 Constituant des acides aminés et nucléiques, l’azote (N) est un élément essentiel pour toutes formes de vie. L’atmosphère terrestre est composée majoritairement d’azote sous forme gazeuse ou moléculaire (N2). Au niveau du sol, les plantes ne peuvent assimiler cet élément que sous forme de nitrate (NO3 – ) et d’ammonium (NH4 + ) par absorption racinaire. L’azote assimilable ne représente cependant que 0,001% de l’azote total de la biosphère (Newton, 1998). Certaines plantes se sont affranchies de ce déficit en azote assimilable en établissant des relations symbiotiques avec des bactéries diazotrophes qui possèdent le complexe enzymatique de la nitrogénase, responsable de la réduction de l’azote moléculaire. Ainsi, les plantes actinorhiziennes établissent une symbiose fixatrice d’azote avec les actinomycètes du genre Frankia. Les plantes de la famille des légumineuses sont associées avec des bactéries du sol regroupées sous le terme de rhizobia. La fixation biologique de l’azote contribue approximativement à 16% de l’apport total d’azote dans les terres cultivées (Ollivier et al., 2011), réduisant ainsi l’apport d’engrais azotés dont environ 50% de la quantité épandue est perdue par lessivage (Graham et Vance, 2000). Bien qu’il existe plusieurs symbioses fixatrices d’azote, la symbiose entre les légumineuses et les rhizobia est la plus étudiée. 

Les légumineuses 

 Intérêt des légumineuses 

Les légumineuses ou Fabaceae représentent la troisième plus grande famille chez les plantes supérieures après les Orchidaceae et les Asteraceae, avec plus de 720 genres et 20000 espèces comptant des espèces herbacées et des arbres (Cronk et al., 2006). Sur la superficie récoltée et de la production totale, cette famille est considérée comme le deuxième groupe de cultures vivrières et fourragères le plus important dans le monde après les céréales. Les légumineuses produisent des protéines en abondance (leurs grains contiennent 3 fois plus de protéines que ceux des céréales), sans fertilisation azotée. Les légumineuses à graines contribuent pour 33% aux besoins azotés de l’alimentation humaine, avec par ordre d’importance le haricot (Phaseolus vulgaris), le pois (Pisum sativum), le pois chiche (Cicer arietinum), la fève (Vicia faba), le pois d’Angole (Cajanus cajan), le pois à vache (Vigna unguiculata) et la lentille (Lens culinaris) (Graham et Vance, 2003). Plus d’un tiers de l’huile végétale consommée pour l’alimentation humaine est fournie par les légumineuses avec en tête le soja et l’arachide. Les légumineuses entrent donc dans l’alimentation humaine mais sont aussi indispensables à la production animale en termes d’aliments et de fourrage. Les légumineuses représentent pour les populations un apport en bois et fourrage (Acacia, Dalbergia, Pterocarpus, etc.). Du fait de cette capacité à établir une symbiose fixatrice d’azote, les légumineuses font partie des plantes pionnières qui permettent la fertilisation des sols. On estime à environ 60 millions de tonnes par an l’azote fixé par les légumineuses cultivées, presque autant que la quantité d’engrais azoté épandue dans la même période (Smil, 1999 ; Graham et Van, 2003). Les légumineuses sont également capables de former des associations symbiotiques avec des rhizobia et des champignons mycorhiziens à arbuscules. 

La phylogénie des Légumineuses 

Les légumineuses appartiennent à la famille des Leguminosae (ou Fabaceae), à l’ordre des Fabales. La famille des Fabaceae se subdivisent en 3 sous-familles de tailles très inégales (Polhill et al., 1981): les Caesalpinioideae, les Mimosoideae et les Papilionoideae. Les Caesalpinioideae forment un groupe très divers de 2 300 espèces réparties en 171 genres et 4 tribus (Lewis et al., 2005). Cette sous-famille rassemble principalement des arbres et arbustes retrouvés en régions tropicales et subtropicales. Parmi les espèces de Caesalpinioideae, seulement 23% ont été décrites comme étant capables de former des Chapitre 1. Revue bibliographique 9 nodosités. Elles sont essentiellement retrouvées parmi les Caesalpinieae et des Cassieae (De Faria et al., 1989). Les Mimosoideae (environ 77 genres réparties entre 3000 espèces) sont présentes principalement dans les forêts tropicales et subtropicales avec notamment les genres Acacia et Albizia (Young et al., 2003). Selon Dommergues et al. (1999), 90 % des espèces examinées chez les Mimosacées sont capables de former des nodosités. Les Papilionoideae constituent la plus grande sous-famille des Fabaceae avec 478 genres et environ 13 800 espèces dont 97% parmi les espèces testées forment des nodosités (De Faria et al., 1989). Les membres de cette sous-famille sont principalement des plantes agricoles et des herbacées des régions tropicales et tempérées (De Faria et al., 1989). 

 Les rhizobia 

Généralités sur les rhizobia Les rhizobia sont des bactéries Gram négatifs, aérobie, non sporulantes. Ils se présentent sous deux formes : La forme végétative : les bactéries sont mobiles par un seul flagelle polaire ou par deux à six flagelles (Somasegaran et Hoben, 1994). Pour les rhizobia à croissance rapide, les cellules sont mobiles par 2-6 flagelles. Celles à croissance lente sont mobiles par un seul flagelle polaire ou un flagelle subpolaire (Somasegaran et Hoben, 1994). La forme bactéroïde : à l’intérieur des nodosités, les rhizobia se transforment en bactéroïdes de forme branchée, sphérique ou en massue (Perry et al., 2004). Les rhizobia peuvent assimiler un large éventail de source de carbone et d’azote dans la rhizosphère (Fuhrer et al., 2005). Les rhizobia à croissance rapide ont une croissance meilleure en présence de glucose, de mannitol ou de saccharose. La majorité des souches à croissance lente préfère le pentose. (Somasegaran et Hoben, 1994). Le trait fonctionnel le plus important des rhizobia est leur capacité à induire des nodosités, sur racines qu’ils colonisent (Batut et al., 2004) et parfois sur les tiges (Dommergues et al., 1999), dans lesquelles ils fixent de l’azote au bénéfice de la légumineuse. 

Diversité taxonomique des rhizobia

 La première bactérie nodulant une légumineuse a été isolée en 1888 par Beijerink. Elle a été initialement nommée Bacillus radicicola, puis renommée Rhizobium leguminosarum (Frank, 1889). Plus tard, la taxonomie des rhizobia a été fortement influencée par la plante hôte qu’ils Chapitre 1. Revue bibliographique 10 sont capables de noduler (Fred et al., 1932). Dans la classification initiale des bactéries (Bergey et al., 1923), la capacité de nodulation a été le critère principal dans la classification des rhizobia. Plus tard, deux groupes de rhizobia ont été distingués sur la base de leur vitesse de croissance (Jordan, 1982) : le genre Rhizobium à croissance rapide, et le genre Bradyrhizobium à croissance lente. Actuellement, le groupe fonctionnel des rhizobiums comprend 98 espèces reparties au sein de 13 genres d’alpha (ou α) protéobactéries et beta (ou β) protéobactéries (Weir, 2016). Toutes les α-protéobactéries appartiennent à l’ordre des Rhizobiales, tandis que les βprotéobactéries appartiennent à l’ordre des Burkholderiales. Les α protéobactéries sont constituées des genres Rhizobium, Ensifer (anciennement Sinorhizobium), Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Methylobacterium, Phyllobacterium, Ochrobactrum, Devosia, Shinella et Aminobacter (Franck, 1889 ; Jordan, 1982 ; Sy et al., 2001 ; Young, 2003 ; Maynaud et al., 2012). Les β-protéobactéries sont composées de : Burkholderia (Chen et al., 2007) et Cupriavidus (anciennement Ralstonia) (Vandamme et Coenye, 2004). D’autres études auraient également identifié la présence de protéobactéries du groupeƔ dans les nodules des légumineuses (Huang et al., 2012). Cette classification des rhizobiums est loin d’être définitive, elle s’affine sans cesse et s’enrichit d’année en année de nouvelles espèces et nouveaux genres de bactéries grâce à l’apparition de nouveaux outils de taxonomie moléculaire et une exploration plus large de la diversité dans des zones à forte biodiversité. 

 Techniques utilisées en taxonomie bactérienne 

 Les gènes ribosomiques 

Les gènes ribosomiques ont été utilisés comme marqueurs moléculaires dans l’étude phylogénétique de différents organismes en raison de leur universalité, leur abondance, leur taille convenable aux analyses comparatives (Ludwig et Schleifer, 1999). Les ADNr contiennent des régions de séquence hautement conservée très utiles pour la désignation des amorces (Hillis et Dixon, 1991) et d’autres régions de séquence suffisamment variable pour servir comme un excellent moyen taxonomique (Grimont et Grimont, 1986). Il existe trois types de l’ADN ribosomique : le 5S, le 16S et le 23S (Jensen et Straus, 1993). L’ADNr 5S est très peu utilisé vu sa petite taille d’environ 120 nucléotides, contrairement à l’ADNr 16S codant pour la petite sous unité ribosomique (SSU : small subunit) d’environ 1500 pb et l’ADNr 23S codant pour la grande sous unité ribosomique (LSU : Large subunit) d’environ 2500 à 3000 pb (Gürtler et Stanisich, 1996). L’espace intergènique entre le 16S et le 23S est transcriptionel d’où la désignation ITS (Intergenic Transcribed Spacer) (Normand et al., 1996). L’analyse de l’ADNr 16S est devenue, depuis le début des années 1990, la technique la plus utilisée pour l’identification, la classification et la phylogénie des bactéries et des autres organismes vivants (Olsen et al., 1994). L’ADNr 16S est qualifié d’horloge moléculaire idéale à l’étude des relations phylogénétiques pour trois raisons principales : (i) il est ubiquitaire chez les bactéries, (ii) sa faible taille (environ 1500 pb) permet un séquençage rapide, (iii) la présence de domaines conservés variables le long de sa séquence permet l’estimation des relations phylogénétiques entre des organismes très proches ou d’une diversité élevée (Schleifer, 2009). Ces régions hautement conservées servent de cibles pour des amorces dites « universelles » pour l’amplification in vitro par PCR et le séquençage (Weisburg et al., 1991). Toutefois, la technique présente un inconvénient incontournable qui est la détection de plusieurs copies divergentes d’ADNr 16S (Amann et al., 2000). Ce serait lié à des transferts latéraux ou des recombinaisons de gènes ADNr 16S entiers donnant naissance respectivement à la présence de plusieurs copies et de séquences chimériques (Wang et Zhang, 2000). Egalement, sa forte conservation dans certains genres ne permet parfois une identification nette entre certaines espèces. Outre le gène codant l’ARNr 16S, l’espace intergénique (ITS) localisé entre les gènes codant pour l’ARNr 16S et l’ARNr 23S a été également utilisé pour étudier la diversité et la structure des rhizobia nodulant A. seyal (Diouf et al., 2007). Cette région présente un polymorphisme de taille très important permettant de différencier des espèces.