Impact des métabolites secondaires de plantes sur des bactéries pathogènes de la rhizosphère

Sources de la contamination 

Les ETM sont des constituants naturels de la croûte terrestre. Des modifications des teneurs en métaux dans les sols résultent de phénomènes naturels (redéposition atmosphérique suite à l’activité volcanique) ou anthropiques (activités minières, industrie chimique, pratiques agricoles). S’ils sont pour certains transformables par des processus d’oxydo-réduction, de méthylation, ils ne sont pas « biodégradables ». 

Sources naturelles 

Les sources les plus importantes d’ETM sont le matériel parental géologique. Les métaux sont libérés lors du processus d’altération des roches pour former le fond géochimique et la composition et les concentrations en métaux dans les sols dépendent du type de roche et de son âge. En outre, les poussières soulevées par le vent et les éruptions volcaniques sont des émetteurs naturels d’ETM dans les écosystèmes (Reichman 2002; Nagajyoti et al. 2010) 

 Sources anthropiques 

Les activités anthropiques sont les principales sources d’émission et de dispersion des ETM dans l’environnement. L’exploitation minière et métallurgique, l’industrie chimique, l’industrie galvanoplastique ou l’industrie nucléaire contribuent à la pollution des écosystèmes par les ETM. D’autre part, les pratiques agricoles utilisant des engrais chimiques pour améliorer la fertilité des sols, ainsi que les activités liées aux transports urbains sont aussi des sources d’introduction d’ETM dans les compartiments sol, eau et atmosphère. Le tableau 1 résume ces principales sources d’ETM.

Les ETM dans un contexte d’interaction plante/microorganisme I

 Le métabolisme secondaire des plantes

 Les métabolites secondaires sont des composés de faible masse moléculaire (<1000 Da généralement) qui ne jouent pas un rôle fondamental pour les plantes comme les métabolites primaires, mais qui sont impliqués dans l’adaptation des plantes à leur environnement, notamment dans les interactions biotiques (Ramakrishna and Ravishankar 2011; Naik and al-Khayri 2016). Une grande variété de métabolites secondaires est synthétisée par les plantes supérieures à partir des métabolites primaires (par exemple carbohydrates, lipides et acide aminés) et sont le résultat d’une co-évolution entre les plantes et leur environnement biotique. Connus comme principes actifs pour la production de médicaments, d’additifs alimentaires et d’arômes, ou de parfums, ils contribuent notamment à la formation des odeurs et des couleurs chez les plantes (Ramakrishna and Ravishankar 2011; Murthy et al. 2014). Leur rôle dans la croissance et le développement des plantes est de plus en plus étudié, notamment afin d’améliorer les techniques de culture. Ils pourraient par exemple fournir aux plantes des avantages dans la survie en les protégeant des stress biotiques ou abiotiques, en améliorant la disponibilité des éléments nutritifs, en agissant comme mécanisme de défense métabolique, ou en améliorant les interactions compétitives avec d’autres organismes (Breitling et al. 2013). Les métabolites secondaires des plantes se répartissent en 3 groupes chimiques : les alcaloïdes, les terpénoïdes et les composés phénoliques. Parmi eux, les polyphénols constituent une vaste diversité de composés bioactifs impliqués dans de nombreux processus d’interactions biotiques depuis la symbiose jusqu’à la résistance aux maladies (Cheynier et al. 2013). Ils sont définis comme des « dérivés non azotés dont le ou les cycles aromatiques sont principalement issus du métabolisme de l’acide shikimique ou/et de celui d’un polyacétate » (Bruneton 2009). Ils sont classés en fonction de leur squelette carboné (ex : phénylpropanoïdes, lignanes, stilbènes, flavonoïdes, anthraquinones). Les polyphénols ont diverses fonctions dans les plantes mais tous ont pour caractéristiques communes de posséder des propriétés antioxydantes et antimicrobiennes plus ou moins marquées du fait de leur fonction phénol. 

 Effets des ETM sur le métabolisme secondaire des plantes

 Parmi les stress abiotiques, les ETM sont connus pour influencer la production de métabolites chez les plantes (Nasim and Dhir 2010). Il a été rapporté que les plantes 23 s’adaptent au stress métallique en changeant leur métabolisme, incluant la production de métabolites secondaires (Singh et al. 2016). Les composés phénoliques sont les plus impactés par les métaux, en raison des groupes (-OH) libres typiquement associés à leurs structures. Lors du stress métallique, les composés phénoliques peuvent jouer le rôle de chélateurs (grâce aux fonctions ortho dihydroxy par exemple) et peuvent également limiter la production d’espèces réactives de l’oxygène (ou « reactive oxygen species » – ROS) générés par les métaux, du fait de leur capacité de piégeage des radicaux libres. L’induction de la biosynthèse des composés phénoliques a été observée chez le blé en réponse à la toxicité du Ni (Diáz et al. 2001). Cependant, il a été rapporté que le Ni inhibait l’accumulation des anthocyanes (Hawrylak et al. 2007; Ramakrishna and Ravishankar 2011). L’augmentation de la teneur en composés phénoliques a également été signalée chez Phaseolus vulgaris en présence de concentrations croissantes de Cd (Dı́az et al. 2001) ou de Pb (Hamid et al. 2010). Diaz et collaborateurs (2001) ont décrit que les feuilles de Phyllantus tenellus contiennent plus de composés phénoliques que celles des plantes contrôle après avoir été pulvérisées avec du CuSO4 (Dı́az et al. 2001). Sous stress Cu, la teneur totale des composés phénoliques chez Brassica juncea est significativement augmentée et ces composés se caractérisent par des activités antioxydantes (Poonam et al. 2015). Melato et al. (2012) ont observé une corrélation linéaire entre la concentration des métaux et la teneur totale en phénols solubles, acides phénols libres et composés phénoliques liés à la paroi cellulaire de Chrysopogon zizanioides, confirmant l’induction de la production des composés phénoliques chez cette plante en présence de concentration élevée en métaux (Melato et al. 2012). En outre, Michalak (2006) a rapporté une corrélation positive entre la production des composés phénoliques et l’activité des enzymes impliqués dans la biogénèse des composés phénoliques, suggérant une synthèse de novo de phénols sous le stress métallique. Cependant, il est également mentionné que l’augmentation de la concentration en flavonoïdes est principalement le résultat d’hydrolyse des conjugués, et non pas d’une biosynthèse de novo (Michalak 2006). En résumé le stress métallique induit globalement la production de composés phénoliques chez les plantes, et leurs propriétés antioxidantes et de chélation des métaux en font des métabolites plus particulièrement intéressants à étudier bien que la majeure partie des études publiées se soient basées sur des analyses quantitatives de la teneur en polyphénols sans s’intéresser qualitativement aux modifications qui pouvaient s’opérer. C’est pourquoi dans le cadre de cette thèse nous privilégierons une approche qualitative. 

La métabolomique, un outil efficace pour l’étude du métabolisme secondaire

 Inventée depuis une vingtaine d’années, la métabolomique est un domaine relativement nouveau de la technologie des «omiques» (incluant la génomique, la transcriptomique et la protéomique comme sciences utilisées pour la compréhension des systèmes biologiques globaux) et qui concerne principalement la caractérisation des métabolites de petite taille utilisant des techniques spectroscopiques telles que la résonance magnétique nucléaire (NMR) ou la spectrométrie de masse (MS) combinée ou non (FT-ICR MS) à la chromatographie liquide ou gazeuse (LC-MS ou GC-MS), ou à l’éléctrophorèse capillaire (CE-MS)(Rochfort 2005; Wishart 2008; Okazaki and Saito 2012; Hong et al. 2016). La métabolomique se focalise principalement sur la quantification et l’identification hautdébit de l’ensemble des petites molécules (<1500 Da) trouvées dans un organe, une cellule ou un organisme, dit métabolome (Wishart 2008). Elle est appliquée dans plusieurs domaines différents dont la recherche et le développement de médicaments, la recherche de biomarqueurs, en santé humaine et animale, en microbiologie, biologie végétale, chimie alimentaire et surveillance de l’environnement (Wishart 2016). La métabolomique a été appliquée dans plusieurs études phytochimiques, en particulier en combinaison avec des analyses multivariées, telles que l’analyse en composantes principales (PCA), l’analyse de regroupement hiérarchique (HCA), ou la régression des moindres carrés partiels (PLS-DA) (Catchpole et al. 2005; Moco et al. 2007; Kusano et al. 2007; Grata et al. 2007; Ku et al. 2010; Okazaki and Saito 2012). Récemment, cette approche a également été utilisée pour corréler le profil métabolique des extraits de plantes avec leurs activités biologiques, afin de mettre en évidence les métabolites discriminants entre les échantillons actifs ou inactifs, par exemple les composés cytotoxiques chez une ronce (Rubus occidentalis), ou l’activité antivirale et anti-VIH de l’acide caffeoylquinique identifié chez Helichrysum populifolium (Lee et al. 2015; Frédérich et al. 2016).

 Impacts des ETM sur les communautés bactériennes du sol

 Au cours des dernières années, de nombreuses recherches se sont focalisées sur l’impact écologique des ETM sur les populations bactériennes du sol. Dans des contextes d’environnement fortement contaminés on peut observer une baisse de la biomasse microbienne, une modification dans l’abondance et la diversité des populations bactériennes avec une diminution des populations les plus sensibles et un enrichissement des plus résistantes, et également l’inhibition de certaines activités bactériennes (Konopka et al. 1999; 25 Turpeinen et al. 2004a; Guo et al. 2009; Berg et al. 2010; Azarbad et al. 2013; Nunes et al. 2016). 

 Approches méthodologiques

 Avant les années 2000s, les études d’impact des ETM sur les communautés microbiennes s’appuyaient principalement sur des approches dépendantes de la culture, c’està-dire impliquant l’isolement et la culture des microorganismes, et sur la mesure de paramètres globaux tels que la biomasse, les activités enzymatiques, les propriétés métaboliques…(Ranjard et al. 2000; Kirk et al. 2004). Ces techniques sont rapides et économiques, cependant, certaines d’entre elles sont considérées comme sélectives car non représentatives de l’ensemble de la communauté microbienne. Par exemple il est estimé que de 0.1% à moins de 10% des bactéries ou champignons retrouvés dans les sols sont cultivables (Ranjard et al. 2000; Gołębiewski et al. 2014). Des avancées importantes en biologie moléculaire et biochimie ont conduit au développement de nouvelles approches indépendantes de la culture basée sur l’analyse des ADNs, ARNs, ou phospholipides extraits directement des échantillons. Parmi les plus anciennes méthodes on peut citer l’analyse des acides gras phospholipidiques (PLFA), méthodes qui ont été longtemps utilisées pour évaluer simultanément l’impact des métaux sur les communautés bactériennes et fongiques de sols (Frostegård et al. 1993; Kelly et al. 1999; Turpeinen et al. 2004a; Chodak et al. 2013; Azarbad et al. 2013). Depuis les années 2000s, plusieurs approches basées sur l’amplification sélective par PCR de fragments d’ADN suivi de leur migration électrophorétique sur gels d’agarose ou de polyacrylamide sont employées. L’une des plus utilisées est l’électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE pour Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Müller et al. 2001; Ellis et al. 2003; Feris et al. 2004; Gremion et al. 2004; Li et al. 2006; Lorenz et al. 2006; Wakelin et al. 2010; Berg et al. 2010; Altimira et al. 2012). Cette méthode est rapide et permet l’analyse simultanée d’un grand nombre d’échantillons. D’autres techniques ont également été développées. On peut ainsi citer des études utilisant l’analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP et T-RFLP) (Sandaa et al. 2001; Turpeinen et al. 2004a; Tipayno et al. 2012) et l’analyse du polymorphisme de taille de l’intergène entre les ADRr 16S et 23S (ARISA) (Lejon et al. 2008; Wood et al. 2016). Plus récemment une utilisation accrue des approches méta(taxo)génomiques et métatranscriptomiques grâce aux techniques de « Next Generation Sequencing » (NGS) a marqué une nouvelle page pour l’analyse des communautés bactériennes. Grâce à ces nouveaux outils il est devenu possible de déterminer avec une plus grande précision la composition de 26 microbiotes complexes et de lier la diversité taxonomique à la diversité fonctionnelle (Fakruddin and Mannan 2013; Gołębiewski et al. 2014). Les plateformes de séquençage les plus utilisées sont celles de Roche, Illumina, Ion Torrent et ABI SOLiD, avec des variations en précision, taux de couverture et biais systématiques (Harismendy et al. 2009; Unno 2015). Ces technologies s’accompagnent de logiciels bioinformatiques pour traiter les données de séquences dont MOTHUR (Schloss et al. 2009) et QIIME (Caporaso et al. 2010), logiciels les plus utilisés pour analyser les séquences du gène codant l’ARNr 16S. De nombreux travaux ont ainsi utilisés le pyroséquençage de ce gène pour étudier l’effet des ETM sur les communautés bactériennes du sol (i.e. Hur et al. 2011; Sheik et al. 2012; Berg et al. 2012; Chodak et al. 2013; Gołębiewski et al. 2014; Pereira et al. 2014; Muehe et al. 2015; Hong et al. 2015; Wang et al. 2016; Nunes et al. 2016). 

 Biomasse microbienne

 Le sol est considéré comme l’un des plus riches réservoirs en microorganismes car il contient divers nutriments nécessaires pour la croissance et le métabolisme bactérien. Un gramme de sol peut contenir jusqu’à plusieurs milliards d’unité de bactéries appartenant à des milliers d’espèces différentes (Rosselló-Mora and Amann 2001). Leita et collaborateurs (1995) ont montré que les ETM affectent la croissance, la morphologie et le métabolisme des microorganismes du sol, par les perturbations fonctionnelles, la dénaturation des protéines ou la destruction de l’intégrité des membranes cellulaires (Leita et al. 1995). Ces modifications pourraient entrainer des diminutions de biomasse microbienne. Plusieurs études ont ainsi fait état d’une réduction de la biomasse bactérienne du sol en conséquence de contamination par les métaux (Konopka et al. 1999; Kelly et al. 1999; Ekelund et al. 2003; Wang et al. 2007b; Guo et al. 2009; Chen et al. 2014). 

 Structure et diversité de la communauté bactérienne 

De nombreuses études ont montré que le stress métallique entraine des modifications plus ou moins importantes de la structure des communautés microbiennes telluriques, cependant les résultats sont souvent contrastés en raison des différences de propriétés physico-chimiques du sol conditionnant la biodisponibilité des métaux, le niveau de contamination, le temps d’exposition ou la résolution des techniques utilisées (Ekelund et al. 2003; Turpeinen et al. 2004; Li et al. 2006; Lorenz et al. 2006; Lejon et al. 2008; Guo et al. 2009; Wakelin et al. 2010; Berg et al. 2012; Singh et al. 2014; Epelde et al. 2015; Azarbad et 27 al. 2016; Nunes et al. 2016). Par exemple, Wakelin et collaborateurs (2010) ont étudié l’impact du Cu sur les communautés bactériennes dans un site contaminé au Cu à Hygum (Danemark) en utilisant la DGGE et ont souligné que la diversité bactérienne augmentait avec le gradient de Cu mais diminuait considérablement lorsque la concentration totale en Cu était supérieure à 560 mg/kg. Un autre travail sur le même site utilisant le séquençage d’ADN à haut débit du gène 16S rRNA a mis en évidence que l’augmentation de la pollution par le Cu n’a pas influencé la richesse taxonomique (Berg et al. 2012). Concernant la composition bactérienne, une des raisons principales de la modification de la biodiversité des communautés bactériennes en présence des ETM est la disparition d’espèces dites sensibles et la sélection et l’enrichissement en populations résistantes (Lenart-Boro and Boro 2014). Cependant, les groupes taxonomiques dominants peuvent être différents selon les études. Ainsi il a été rapporté que des concentrations accrues en Cu conduisent à une réduction de la proportion relative des Proteobacteria tant au sein de la communauté totale (Berg et al. 2012) qu’au sein de la communauté transcriptionnellement active (Nunes et al. 2016). Au contraire, il a été observé en présence de Cu une augmentation de l’abondance relative des Proteobacteria (Turpeinen et al. 2004) et une hausse des Firmicutes (Ekelund et al. 2003) (cf IV.1).