l’ATP synthase des mycobactéries
Les mycobactéries
Classification des mycobactéries
Les mycobactéries appartiennent au genre Mycobacterium, à la famille des Mycobacteriaceae et à l’ordre des Actinomycétales. Grâce aux nouvelles technologies qui ont énormément amélioré les méthodes d’identification, on compte à ce jour plus de 130 espèces mycobactériennes, avec une majorité d’espèces environnementales. On considère que les espèces isolées à partir de l’homme sont seulement la pointe de l’iceberg de toutes les espèces existantes (Hale, Pfyffer et al. 2001; Tortoli, Rindi et al. 2003; Primm, Lucero et al. 2004; Tortoli 2006). Les mycobactéries possèdent trois caractéristiques essentielles (Shinnick and Good 1994) : l’acido-alcoolo-résistance. Les mycobactéries sont résistantes à la décoloration par l’action simultanée de l’acide et de l’alcool, principe de base de la coloration de Ziehl-Neelsen, d’où l’appellation de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR). Cette propriété est liée à la présence d’une paroi très riche en lipides spécifiques, les acides mycoliques, qui font de la paroi mycobactérienne la paroi plus épaisse du monde bactérien (9-10 nm). la nature des acides mycoliques. Les acides mycoliques sont les acides gras les plus longs synthétisés dans la nature (Niederweis 2003). Les genres Mycobacterium, Nocardia, Corynebacterium, Rhodococcus, Gordona et Tsukamurella ont tous des acides gras α-ramifiés β-hydroxylés : les acides mycoliques. Ceci explique que les germes correspondant peuvent être colorés par la coloration de Ziehl-Neelsen. Le genre Mycobacterium se différencie des autres par le haut poids moléculaire de ses acides mycoliques (chaînes de 60 à 90 atomes de carbone, contre 30 à 60 atomes de carbone pour Rhodococcus et Nocardia et de 20 à 30 pour les corynébactéries). un contenu élevé en G+C% de leur ADN. Le pourcentage en G+C de l’ADN des mycobactéries est élevé : 61% à 71%, excepté pour Mycobacterium leprae (55%) (Andersson and Sharp 1996). Différentes classifications ont été utilisées pour distinguer les nombreuses espèces de mycobactéries : selon le temps de croissance, croissance lente >7 jours ou croissance rapide <7 jours ; selon la pathogénicité, pathogènes stricts de l’homme ou des animaux, espèces saprophytes ou commensales, pathogènes opportunistes ou non pathogènes ; selon la maladie qu’elles entraînent, tuberculose (TB), lèpre ou mycobactérioses. D’un point de vue médical, les mycobactéries peuvent être classées en trois grandes catégories. La première comprend les mycobactéries responsables de la TB des mammifères ou mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis : M. tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium canettii, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium caprae et Mycobacterium microti. La deuxième catégorie est représentée par M. leprae et Mycobacterium lepraemurium, responsables respectivement de la lèpre de l’homme et de la lèpre du rat. La troisième catégorie comprend toutes les autres mycobactéries : saprophytes ou commensales des animaux, qui sont désignées par le terme générique de mycobactéries « atypiques » (NTM, Nontuberculous Mycobacteria). Ces espèces, dans certaines conditions, peuvent être responsables d’infections opportunistes chez l’homme (Mycobacterium avium, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum…). La plus pathogène d’entre elles produit une toxine dermonécrotique (Mycobacterium ulcerans).
Caractéristiques bactériologiques des mycobactéries
Les mycobactéries sont des bacilles aérobies stricts ou microaérophiles, immobiles, non sporulés. Elles sont très résistantes à la dessiccation et survivent jusqu’à plusieurs années à l’état desséché. Bien qu’elles ne se colorent que très faiblement par la coloration de Gram, les mycobactéries ont longtemps été rattachées aux bactéries à Gram positif mais leur paroi possède toutefois des caractéristiques communes aux bactéries à Gram négatif (Fu and Fu-Liu 2002). Les mycobactéries se distinguent des autres espèces bactériennes par leurs exigences de culture et leur lenteur de croissance. Seuls les milieux qui contiennent du sérum, de la glycérine, de la pomme de terre glycérinée, de l’œuf ou de l’albumine bovine permettent une culture abondante : milieu LöwensteinJensen, milieux de Middlebrook (7H9, 7H10, 7H11) supplémentés par de l’OADC (acide oléique, albumine, dextrose et catalase). Leur température optimale de croissance varie de 30°C à 45°C. Leur temps de génération varie de 2 heures à 20 heures pour la majorité des mycobactéries mais peut aller jusqu’à 14 jours pour M. leprae, seule mycobactérie qui ne peut pas être cultivée in vitro. Des colonies sur milieux gélosés apparaissent après 2 jours d’incubation pour les mycobactéries à croissance rapide et jusqu’à 12 semaines pour les mycobactéries à croissance lente. Parasite strict de l’homme, M. tuberculosis est le principal agent de la tuberculose (TB) humaine. Son temps de division est en moyenne de 20 heures, les cultures sur milieu solide ne sont positives qu’après 21 à 28 jours d’incubation à 37°C, et après un délai un peu plus court (10 à 15 jours) lorsqu’on utilise un milieu liquide. Sur les milieux contenant de l’œuf, les colonies sont de couleur crème-beige, sèches, rugueuses, en « chou-fleur ».
Principales caractéristiques du génome des mycobactéries
Aujourd’hui, nous avons à notre disposition sur le site du NCBI (National Center for Biotechnology Information) la séquence du génome de 13 mycobactéries, dont M. tuberculosis, M. leprae, M. bovis, M. smegmatis et M. ulcerans. La taille du génome des mycobactéries varie de 3.2×106 pb pour M. leprae à pratiquement 7×106 pb pour M. smegmatis. Il est en général plus grand que celui des autres organismes procaryotes (le génome de Streptococcus pneumoniae a par exemple une taille de 2.0×106 pb, celui de Escherichia coli de 4.6X106 pb). La séquence complète du génome de M. tuberculosis H37Rv a été publiée en 1998. Le génome contient 4.4×106 pb et se caractérise par une teneur en guanine et cytosine (G+C) élevée (66%) (Cole, Brosch et al. 1998) La teneur en G+C% est élevée pour toutes les mycobactéries, entre 61 et 71% contre 25 à 75% dans le monde procaryote (56% pour E. coli). La richesse en G+C du genre mycobactérien explique en partie que le codon GTG soit utilisé comme codon d’initiation pour 35% des gènes de M. tuberculosis (contre 14% chez E. coli), mais également que les différentes protéines de mycobactéries soient composées préférentiellement d’acides aminés codés par des codons riches en G et C (Ala, Gly, Pro, Arg et Trp) (Cole, Brosch et al. 1998; Cole 2002). M. tuberculosis, comme les autres mycobactéries à croissance lente, possède une seule copie de l’opéron ribosomal qui est éloigné de 1 Mpb de l’origine de réplication oriC. Chez les autres espèces bactériennes, il y a en général plusieurs copies de cet opéron (7 chez E. coli) dont l’une au moins est située près de l’origine de réplication (Cole, Brosch et al. 1998). Par ailleurs, 59% des gènes sont transcrits dans le même sens que la fourche de réplication ce qui peut expliquer en partie la lenteur de croissance. Le génome de M. tuberculosis est caractérisé par un grand nombre de gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras (8% du génome environ) : il en contient 250, alors que le génome de E. coli n’en contient que 50 (1.5% du génome environ). Ceci est vraisemblablement lié à la capacité de M. tuberculosis à synthétiser des acides gras, des plus simples comme l’acide palmitique aux plus complexes comme les acides mycoliques qui entrent dans la composition de sa paroi (Cole, Brosch et al. 1998).
Table des matières
REMERCIEMENTS
SOMMAIRE
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
ABREVIATIONS
INTRODUCTION
1. LES MYCOBACTERIES
1.1. CLASSIFICATION DES MYCOBACTERIES
1.2. CARACTERISTIQUES BACTERIOLOGIQUES DES MYCOBACTERIES
1.3. PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DU GENOME DES MYCOBACTERIES
1.4. ENVELOPPE MYCOBACTERIENNE
2. LA TUBERCULOSE
2.1. NOMBRE DE CAS ET LOCALISATION DANS LE MONDE
2.2. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA TUBERCULOSE
2.3. LE TRAITEMENT DE LA TUBERCULOSE
2.3.1. Antibiotiques de première ligne et leur mode d’action
2.4. LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES
2.4.1. Resistance naturelle
2.4.2. Resistance acquise
2.4.3. MDR-TB et XDR-TB
2.4.3.1. MDR-TB
2.4.3.2. XDR-TB
2.4.3.3. Traitement des cas de MDR-TB et XDR-TB
3. LES NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES ET LE TMC207
3.1. LES NOUVEAUX ANTITUBERCULEUX
3.2. LE TMC207
3.2.1. Identification de la cible du TMC207
3.2.2. Essais cliniques
3.2.2.1. Etudes chez la souris
3.2.2.2. Etudes chez le cochon d’Inde
3.2.2.3. Etudes chez l’homme
3.2.3. Le TMC207 et les bactéries en phase non-réplicative
3.2.4. Etudes in vivo sur les autres mycobactéries pathogènes
4. ATP SYNTHASE
4.1. LA FAMILLE DES ATPASES
4.2. L’ATP SYNTHASE : GENERALITES ET PLACE DANS LA CELLULE
4.3. STRUCTURE DU DOMAINE F1 DE L’ATP SYNTHASE
4.3.1. Les sous-unités α et β
4.3.2. La sous-unité γ
4.3.3. La sous-unité δ
4.3.4. La sous-unité ε
4.4. STRUCTURE DU DOMAINE FO DE L’ATP SYNTHASE
4.4.1. La sous-unité a
4.4.2. La sous-unité b
4.4.3. La sous-unité c
4.5. MECANISME D’ACTION DE L’ATP SYNTHASE
4.5.1. La synthèse de l’ATP via le domaine F1
4.5.2. Le transfert des ions via le domaine FO
4.5.3. La synthèse de l’ATP via le domaine F1 se fait grâce au transfert des ions via le domaine FO
4.6. L’ATP SYNTHASE DES MYCOBACTERIES
4.6.1. La chaîne respiratoire mycobactérienne
4.6.2. Caractéristiques de l’ATP synthase mycobactérienne
4.6.3. Régulation de l’ATP synthase mycobactérienne
4.6.4. Régulation de l’ATP synthase dans les bacilles en phase de dormance
5. OBJECTIFS DU PROJET
MATERIEL ET METHODES
1. TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
1.1. SELECTION DES MUTANTS RESISTANTS AU TMC
1.2. PREPARATION DES CELLULES ELECTROCOMPETENTES
1.3. TRANSFORMATION PAR ELECTROPORATION DE M. SMEGMATIS
1.3.1. Transformation de M. smegmatis pour les tests de complémentation
1.3.2. Transformation de M. smegmatis pour les tests d’inactivation
1.4. CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE (CMI) DU TMC207
1.4.1. Mesure de la CMI pour les clones résistants au TMC207
1.4.2. Mesure de la CMI pour les souches de M. smegmatis complémentées
2. TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
2.1. AMPLIFICATIONS PAR POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
2.1.1. Amplification des gènes atpE et atpB des clones résistants au TMC207
2.1.2. Amplification de l’opéron atp de M. tuberculosis
2.1.3. Amplification de la région de régulation de l’opéron atp des clones de M. abscessus
et M. tuberculosis résistantes au TMC207
2.1.4. Amplification des gènes rv1846c, rv1845c, mab2414 et mab2415 des souches de M. abscessus et M. tuberculosis résistantes au TMC207
2.1.5. Analyse des clones de M. smegmatis obtenus dans le cadre de l’inactivation du gène atpE
2.2. SEQUENÇAGE DES PRODUITS D’AMPLIFICATION
2.3. SOUTHERN BLOT
2.3.1. Southern Blot pour déterminer le nombre de copie du gène atpE dans le génome de M. smegmatis et M. tuberculosis
2.3.2. Southern Blot pour l’analyse des clones de M. smegmatis obtenus lors des tests
d’inactivation du gène atpE
2.3.3. Transfert des fragments de la digestion sur une membrane et hybridation de la sonde
2.4. LES CLONAGES
2.4.1. Les vecteurs pLYGatpEsme et pLYGatpEBK : clonage du gène atpE de M. smegmatis
et de M. tuberculosis dans le vecteur pLYG204.zeo pour les tests de complémentation
2.4.1.1. Amplification du gène atpE de M. smegmatis et de M. tuberculosis
2.4.1.2. Premier clonage dans le vecteur pMOSBlue
2.4.1.3. Clonage dans le vecteur pLYG204.zeo
2.4.2. Clonage du gène atpD de M. smegmatis dans le vecteur pLYG204.zeo pour les tests
d’expression et purification de l’ATP synthase : vecteur pLYGatpDsme6H
2.4.3. Clonage du gène atpE de M. tuberculosis dans le vecteur pET29a pour les tests
d’expression et purification de l’ATP synthase : vecteurs pET29atpEBK et pET29atpEBK6H
2.4.4. Clonage du gène atpE de M. tuberculosis dans le vecteur pET28a pour les tests
d’expression et purification de l’ATP synthase : vecteur pET28atpEBK6H
2.5. MUTAGENESE DIRIGEE
2.5.1. Mutagénèse dirigée des vecteurs de la complémentation génique
2.5.2. Mutagénèse dirigée pour la construction d’un plasmide d’expression de la sous-unité
c de M. smegmatis avec un His-Tag
2.6. CONSTRUCTION D’UNE CASSETTE D’INACTIVATION DU GENE ATPE DE M. SMEGMATIS
2.6.1. Amplification de 1000 pb en amont et en aval du gène atpE de M. smegmatis et amplification du gène aph
2.6.1. Long-flanking homology (LFH)- PCR
2.7. CONSTRUCTION D’UN VECTEUR D’INACTIVATION
2.7.1. Première stratégie pour la construction du vecteur suicide
2.7.1.1. Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pCR2.1-TOPO
2.7.1.2. Clonage de la cassette d’inactivation dans le vecteur pGOAL
2.7.2. Deuxième stratégie pour la construction du vecteur suicide
2.7.2.1 Amplification de 1000 pb aux extrémités du gène atpE de M. smegmatis et amplification du gène aph
2.7.2.2. Clonage dans le plasmide pCR2.1-TOPO
2.7.2.3. Clonage dans le vecteur p2NIL
2.7.2.4. Insertion des autres marqueurs de sélection dans le plasmide p2NIL contenant la cassette d’inactivation
2.8. REVERSE TRANSCRIPTION – PCR EN TEMPS REEL
2.8.1. Extraction de l’ARN total de M. abscessus
2.8.2. Réaction de RT-PCR en temps réel – TaqMan
2.8.3. Analyse des résultats de RT-PCR en temps réel
3. TECHNIQUES DE BIOLOGIE STRUCTURALE
3.1. CONSTRUCTION DU MODELE STRUCTURAL DE L’ANNEAU DE SOUS-UNITE C MYCOBACTERIEN
3.2. DOCKING DU TMC207 DANS LES MODELES
4. TECHNIQUES DE PURIFICATION DES PROTEINES MEMBRANAIRES
4.1. EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA SOUS-UNITE C DE M. TUBERCULOSIS
4.1.1. Expression hétérologue chez E. coli et purification de la sous-unité c de M. tuberculosis
avec ou sans un His-Tag
4.1.2. Expression in vitro de la sous-unité c de M. tuberculosis
4.1.3. Expression hétérologue chez E. coli et purification de la sous-unité c de M.
tuberculosis sous forme d’une protéine de fusion avec la Maltose Binding Protein
4.1.3.1. Production de la protéine
4.1.3.2. Purification de la protéine
4.1.3.3. Digestion de la protéine de fusion MBP-His-suc avec la thrombine
4.1.3.4. Digestion de la protéine de fusion His-MBP-suc avec la protéase TEV
4.2. EXPRESSION ET PURIFICATION DE L’ATP SYNTHASE DE M. SMEGMATIS
4.2.1. Expression homologue de la sous-unité c de M. smegmatis chez M. smegmatis sans tag
4.2.2. Expression homologue de la sous-unité c de M. smegmatis chez M. smegmatis avec un His-Tag
4.2.3. Expression homologue de la sous-unité β de M. smegmatis chez M. smegmatis
4.3. PRECIPITATION DES PROTEINES A L’ACIDE TRICHLOROACETIQUE (TCA)
4.4. WESTERN BLOT
4.5. BLUE NATIVE (BN) – PAGE
5. TECHNIQUES DE BIOPHYSIQUE
5.1. LA CRISTALLISATION
5.1.2. Principe de la cristallisation
5.1.2. Test de cristallisation de la protéine de fusion MBP+His-suc
5.1.3. Test de cristallisation de l’ATP synthase de M. smegmatis
5.2. LA SPECTROMETRIE DE MASSE
5.2.1. Principe de la spectrométrie de masse
5.2.2. MALDI-TOF
5.2.3. NanoLC-ESI-MS/MS
5.2.4. Préparation de l’échantillon pour la spectrométrie de masse
5.2.5. Analyse des résultats obtenus en spectrométrie de masse
5.3. MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
5.3.1. Principe de la microscopie électronique
5.3.2. Préparation des échantillons pour la microscopie électronique et analyses des images
ETUDE DE LA RESISTANCE AU TMC
1. ETUDE DES MUTANTS RESISTANTS AU TMC207
2. COMPLEMENTATION GENIQUE
3. INACTIVATION DU GENE ATPE
4. UN AUTRE MECANISME DE RESISTANCE ?
5. MODELES STRUCTURAUX DES ANNEAUX C DE M. TUBERCULOSIS ET DE M.SMEGMATIS
6. DOCKING DU TMC207 DANS LE MODELE DE L’ANNEAU DE SOUS-UNITES C DE M.
TUBERCULOSIS
EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA SOUS-UNITE C DE L’ATP SYNTHASE MYCOBACTERIENNE
1. LES PROTEINES MEMBRANAIRES
2. LES DETERGENTS
3. EXPRESSION ET PURIFICATION DE LA SOUS-UNITE C DE M. TUBERCULOSIS
4. EXPRESSION ET PURIFICATION DE L’ATP SYNTHASE DE M. SMEGMATIS :
PREMIERES ANALYSES EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES
ANNEXE 1 : CARTE DES VECTEURS UTILISES
ANNEXE 2 : SCHEMA DES ETAPES DE LA PURIFICATION D’UNE PROTEINE MEMBRANAIRE
ANNEXE 3 : TABLEAU RECAPITULATIF DES TESTS D’EXPRESSION DE LA SOUS-UNITE C
DE M. TUBERCULOSIS CHEZ E. COLI
ANNEXE 4 : CODES PDB DE TOUTES LES STRUCTURES RESOLUES DES SOUS-UNITES
DE LA F1FO-ATP SYNTHASE
ANNEXE 5 : PUBLICATION
REFERENCES
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