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Le système circulatoire et l’immunité des céphalopodes

Le système circulatoire de Sepia officinalis

En comparant l’organisation du système circulatoire des céphalopodes Coléoidés à celui des autres invertébrés (e.g. arthropodes et autres mollusques), Schipp (1987a) décrit un groupe ayant atteint un niveau d’évolution particulièrement élevé (Fig. 1.8).
En effet, le système circulatoire des céphalopodes est clos, composé d’un système arté-riel, principalement dorsal, relié à un système veineux ventral par un réseau capillaire. La circulation de l’hémolymphe est assurée par un cœur central (dit systémique) composé d’un ventricule et de deux auricules, responsable de la circulation artérielle à travers deux aortes, appelées céphalique et postérieure. La circulation veineuse est assurée par des vaisseaux contractiles et deux cœurs branchiaux, qui conduisent l’hémolymphe dans les branchies à une pression optimale pour permettre les échanges gazeux (Mangold et Bidder, 1989a; Shad-wick et Nilsson, 1990; King et al., 2005; Schipp, 1987b; Barber et Graziadei, 1965). Les cœurs branchiaux sont pourvus d’appendices en charge de l’ultrafiltration de l’hémolymphe pour la formation primaire d’urine. Trois types cellulaires sont retrouvés dans les tissus des cœurs branchiaux et de leurs appendices : les rhogocytes (anciennement appelés les cellules ovoïdes), les hémocytes et les cellules mésenchymatiques triangulaires. Ces cellules sont toutes impliquées dans la destruction de composés allogéniques présents dans l’hémolymphe via des processus d’endocytose, ainsi que dans l’excrétion de composés intervenant dans les défenses immunitaires. Le complexe des cœurs branchiaux participe également au catabolisme de l’hé-mocyanine (Hcy), ainsi qu’au stockage de cette molécule et d’éléments traces essentiels tels que le Cu et le Fe (retrouvés à des concentrations importantes dans ces organes), mais aussi non essentiels comme le Cd, probablement excrété dans l’urine (Fiedler et Schipp, 1987; Schipp et Hevert, 1978; Beuerlein et al., 1998; Beuerlein et Schipp, 1998; Beuerlein et al., 2000, 2002a; Bustamante et al., 2002b). L’hémolymphe est constituée du plasma dans lequel circulent les hémocytes, principales cellules du système immunitaire. Le plasma est essentiellement composé d’Hcy (à plus de 90 %), le pigment respiratoire, dont l’apoprotéine est synthétisée par les glandes branchiales (D’Aniello et al., 1986; Mangold et Bidder, 1989a; Schipp et Hevert, 1978; Schipp et al., 1973), et d’α2-macroglobuline, un inhibiteur de protéases à large spectre impliqué dans l’immunité (Thøgersen et al., 1992; Armstrong, 1992, 2010; Vanhoorelbeke et al., 1994). Les hémocytes, cellules de première importance dans les processus de défense immunitaire, sont synthétisés par les corps blancs, organes pairs multi-lobés situés au niveau de la tête, entre les lobes optiques et les yeux. A ce jour, un seul type d’hémocytes a été décrit chez Sepia officinalis (Claes, 1996; Mangold et Bidder, 1989a).

Rappel des connaissances sur le système immunitaire des céphalopodes

Bien que de plus en plus étudié, le fonctionnement du système immunitaire des inverté-brés reste mal compris. Il est classiquement mis en opposition avec celui des vertébrés qui possèdent un système immunitaire dit « acquis » ou « adaptatif » qui confère à son hôte une ca-pacité de réponse spécifique à un agent pathogène ainsi qu’une réponse « mémoire » permettant une élimination ciblée plus efficace. Ce système immunitaire adaptatif est complémentaire du système immunitaire inné que l’on retrouve chez tous les êtres vivants pluricellulaires ani-maux et végétaux (Iwanaga et Lee, 2005; Loker et al., 2004). Au sein des invertébrés, ce sont les insectes, et particulièrement Drosophila melanogaster, qui ont servi de modèle d’étude du système immunitaire inné. Les travaux concernant les organismes marins ne sont apparus que plus récemment, notamment en lien avec le développement de l’aquaculture et des phéno-mènes de mortalité massive liés à des pathogènes, des contaminants, et/ou d’autres facteurs environnementaux (e.g. Lotz, 1997; Wang et al., 2013b; Xue et Renault, 2000; Vazquez et al., 2009). Parmi les mollusques, le fonctionnement de l’immunité a principalement été étudié chez les bivalves en raison de leur importance économique, et dans une moindre mesure chez les gastéropodes, pour leur rôle de vecteur de parasites vis-à-vis de l’homme et/ou d’animaux d’élevage (Ford, 1992; Donaghy et al., 2010; Loker et al., 2004). Au sein des céphalopodes, malgré les particularités évolutives de leur système circulatoire, peu d’études descriptives du fonctionnement du système immunitaire ont été menées (Malham, 1996; Castellanos-Martínez, 2013). Par conséquent, la description ci-dessous, généraliste à l’exception des su-jets spécifiquement abordés dans notre étude, empruntera les connaissances acquises au sein d’autres groupes d’invertébrés (i.e. mollusques et crustacés) avant de développer les travaux réalisés chez les céphalopodes.
Le système immunitaire inné est traditionnellement présenté comme étant composé des processus à médiation humorale, qui correspondent aux composés dissous, qu’ils soient pré-sents dans l’hémolymphe ou dans des vésicules intracellulaires, et à médiation cellulaire, qui se rapportent à l’action des hémocytes. Ces deux processus sont étroitement connectés et agissent en synergie.

La médiation humorale

L’organisation de la médiation humorale peut être présentée en trois sous-groupes : 1) les récepteurs de reconnaissance du corps étranger (PRRs), 2) les voies de signalisation de la réponse immunitaire, et 3) les effecteurs immunitaires.
1) Parmi la multitude de récepteurs de reconnaissance de corps étrangers (PRRs) connus chez les invertébrés, les lectines sont les principales molécules ayant été étudiées chez les céphalopodes (Rögener et al., 1985; Alpuche et al., 2010). Il s’agit de protéines ou glycoprotéines qui se lient spécifiquement aux carbohydrates présents sur les membranes bactériennes (Castellanos-Martínez et Gestal, 2013; Wang et al., 2012). Bien que toutes leurs fonctions n’aient pas encore été décrites, leur implication a été rapportée dans la reconnaissance du non-soi, l’agglutination et l’opsonisation (i.e. processus facilitant la phagocytose) des bacté-ries, ainsi que dans l’activation du système du complément (Matsubara et al., 2006; Pruzzo et al., 2005; Fujita, 2002). Les trois principaux groupes de lectines décrits chez les mollusques sont les galectines, lectines les plus étudiées et conservées au sein du règne animal, qui se lient au β-galactoside ; les lectines C, qui présentent une activité de liaison dépendante de l’ion Ca2+ ; et les lectines de type I, qui se lient spécifiquement à l’acide sialique. De récentes études (Lehmann et al., 2006; Vasta, 2009; Kolarich et al., 2012) ont mis en évidence la nature de leur forme, soluble ou membranaire, chez les bivalves (Fig. 1.9).
Chez les céphalopodes, la présence de lectines dans le plasma est connue depuis longtemps. Dans les années 1990, une lectine C de 260 kDa issue du plasma d’Octopus vulgaris a été caractérisée (Rögener et al., 1985) et l’agglutination de différentes souches bactériennes par les plasma d’Octopus maya, Sepiotheutis lessoniana, et S. officinalis a été mise en évidence. Plus récemment, des séquences homologues d’ARN de lectines C spécifiques du mannose (Castellanos-Martínez, 2013) et de galectines ont été extraites d’hémocytes d’O. vulgaris et d’Euprymna scolopes (Castellanos-Martínez, 2013; Collins et al., 2012). Une autre lectine de 66 kDa issue du plasma d’O. maya et montrant une activité d’agglutination a également été caractérisée (OmA). Cette lectine ne montre pas de similarités avec les séquences peptidiques de lectines connues, mais présente des homologies avec une Hcy d’Octopus dofleini (Alpuche et al., 2010).
L’implication de l’Hcy dans le système immunitaire des invertébrés semble de plus en plus évidente. Chez les céphalopodes, cette molécule représente la quasi-totalité des protéines présentes dans le plasma (D’Aniello et al., 1986) et sa plurifonctionnalité (e.g. lectine, phé-noloxydase, précurseur de peptides antimicrobiens) a été mise en évidence chez de nombreux invertébrés (e.g. Coates et Nairn, 2014; Decker et Jaenicke, 2004). Ce pigment respiratoire, bleu sous sa forme oxydée, est une protéine de poids moléculaire élevé qui possède un site actif à deux ions cuivre, maintenus par six résidus histidine, permettant la liaison réversible d’une molécule de dioxygène. Chez S. officinalis, la molécule d’Hcy est un décamère, consti-tué de sous-unités de 350-450 kDa, de forme cylindrique. Chaque sous-unité est composée de huit unités fonctionnelles (désignées de a à h à partir de l’extrémité N-terminale) d’environ 50 kDa (Fig. 1.10). Plusieurs études ont souligné la capacité de la molécule d’Hcy à présenter une activité de type phénoloxydase chez les céphalopodes (Campello et al., 2008; Siddiqui et al., 2006; Decker et Tuczek, 2000; Decker et al., 2007; Salvato et al., 1998). Siddiqui et al. (2006) ont d’ailleurs montré que cette activité, issue du plasma de S. officinalis, avait pour seule origine l’Hcy, et que l’unité fonctionnelle g de cette molécule en est la principale respon-sable. Le rôle et le fonctionnement des enzymes de type phénoloxydases seront développés ci-dessous.
D’autres PRRs ont été récemment mis en évidence dans les tissus des céphalopodes O. vulgaris et E. scolopes, parmi lesquels on trouve des protéines de liaison aux β-1,3-glucane, lipopolysaccharide et peptidoglycane (βGBPs, LGBP, PGBP, PGRP, GNBPs), et des récep-teurs de type Toll (TLRs) (Castellanos-Martínez, 2013; Collins et al., 2012; Troll et al., 2009; Goodson et al., 2005), mais leur fonctionnement n’a pas encore été étudié.
2) Les principales voies de signalisation de la réponse immunitaire décrites chez les invertébrés, notamment les mollusques, sont le système du complément, la cascade Toll/NF-κB, les cascades protéolytiques et le système prophénoloxydase (proPO).
– Le système du complément est l’un des plus anciens systèmes de défense du règne animal (Castillo et al., 2009). Il comprend plus d’une trentaine de protéines sériques et mem-branaires qui jouent un rôle essentiel dans les défenses immunitaires innées. L’activation de ce système induit trois principales activités : le déclenchement de l’inflammation, l’opsonisa-tion des pathogènes, et leur lyse (Fujita, 2002; Castillo et al., 2009). Il a surtout été décrit chez les mammifères, mais certains de ses composants ont été récemment mis en évidence chez des céphalopodes (Collins et al., 2012; Castillo et al., 2009; Schleicher et Nyholm, 2011; Castellanos-Martínez, 2013).
– La cascade Toll/NF-κB (également appelée Toll) est initiée par l’activation des ré-cepteurs du même nom (Toll-like receptors) qui sont des protéines transmembranaires situées
à l’interface extra-/intracellulaire ou à l’intérieur de la cellule, dans un endosome. Cette cas-cade entraîne l’activation de processus très divers comme l’inflammation, l’apoptose et les cascades protéolytiques.
– Les cascades protéolytiques immunitaires font partie des premières cascades dé-clenchées lors d’une infection. En effet, la libération de protéases par l’organisme va entraîner le déclenchement d’autres voies de signalisation telles que les systèmes proPO et du complé-ment. Les inhibiteurs de protéases, comme les α2-macroglobulines, font également partie de ces voies de signalisation. Ils régulent l’action des protéases endogènes et empêchent les protéases synthétisées par les pathogènes d’avoir des effets délétères à l’intérieur de l’orga-nisme infecté (Armstrong, 2006, 2010; Wang et al., 2013b). En raison de la diversité des protéases, les inhibiteurs de protéases sont impliqués dans de nombreux processus dont un certain nombre est encore mal compris.
Au sein du système immunitaire des invertébrés, il a été montré que des inhibiteurs de protéases sont impliqués dans la régulation de la coagulation de l’hémolymphe, des cascades prophénoloxydase et du complément, et dans la synthèse de cytokines et de peptides antimicrobiens (Agarwala et al., 1996; Tong et Kanost, 2005; Xue et al., 2009). La plupart de ces molécules inhibent de façon spécifique les enzymes protéolytiques d’une seule classe mécanis-tique (i.e. protéases aspartiques, protéases à cystéines, protéases à sérines, métalloprotéases) en agissant sur leur structure pour les inactiver de façon irréversible (Umasuthan et al., 2014; Xue et al., 2009; Huntington et al., 2000). Les α2-macroglobulines, qui sont présentes dans le plasma de la plupart des métazoaires, agissent différemment en formant une cage autour de la protéase qui va limiter son action sans l’inactiver. De plus, l’action de ce groupe d’inhibiteurs de protéases n’est pas limitée à une classe mécanistique (Armstrong, 2010).
Chez les céphalopodes, la présence des α2-macroglobulines a été mise en évidence dans les plasma d’O. vulgaris, d’Eledone cirrhosa, de S. officinalis et de Loligo pealii (Vanhoorelbeke et al., 1994; Thøgersen et al., 1992; Armstrong, 1992; Malham et al., 1998b). Vanhoorelbeke et al. (1994) ont même souligné que cette protéine est la deuxième plus abondante dans le plasma de S. officinalis après l’Hcy. D’autres études ont mesuré d’importantes activités in-hibitrices de protéases dans la glande digestive de différents céphalopodes (Kishimura et al., 2010, 2001; Sof’ina et al., 1988; Ishikawa et al., 1966).
– Les phénoloxydases (POs) sont des métalloprotéines à cuivre qui catalysent la pre-mière étape de la mélanisation (production de la mélanine ou mélanogenèse), c’est-à-dire l’hy-droxylation et/ou l’oxydation d’un composé phénolé (tyrosine et 3,4-dihydroxyphénylalanine). Chez les invertébrés, la mélanisation joue un rôle important dans la reconnaissance du non-soi, la production de substances toxiques pour les agents pathogènes, la réparation des blessures, le durcissement de la cuticule et l’apparition de facteurs stimulant les défenses cellulaires (i.e. phagocytose et/ou encapsulation ; Cerenius et al., 2008). Récemment, les recherches concer-nant les POs ont visé à déterminer plus précisément la nature des POs étudiées (Le Bris et al., 2013, 2014; Luna-Acosta, 2010). En effet, ce groupe d’enzymes comprend les tyrosinases, les catécholases et les laccases. Toutes trois peuvent catalyser l’oxydation d’o-diphénols (activité catécholase), cependant les tyrosinases ont également la capacité de réaliser l’orthohydroxy-lation des monophénols (activité crésolase), tandis que les laccases sont aussi capables de catalyser l’oxydation de m- et p-diphénols, ainsi que d’autres composés comme les amines aromatiques (activité laccase).
Une caractéristique des POs réside dans leur forme inactive : la prophénoloxydase (proPO).
La cascade proPO correspond aux étapes nécessaires à l’activation de la proPO en PO. Cette cascade est initiée par la reconnaissance de motifs présents sur les pathogènes (PAMPs) qui induit (directement ou via des PRRs) le déclenchement d’une cascade de protéases à sérine aboutissant à la conversion de la forme zymogénique proPO en PO (Fig. 1.11).
Chez les céphalopodes, en dehors des tyrosinases impliquées dans la synthèse de l’encre, les POs en tant que composant du système immunitaire n’ont pas été spécifiquement étu-diées (Fan et al., 2009; Fiore et al., 2004; Naraoka et al., 2000, 2003; Palumbo et al., 1997). Plusieurs travaux ont porté sur l’activité PO générée par l’Hcy (Campello et al., 2008; Sal-vato et al., 1998; Siddiqui et al., 2006; Decker, 1998). En effet, les Hcys d’un grand nombre d’invertébrés peuvent présenter des activités POs (appelées Hcy-derived PO) en fonction de l’accessibilité de leur site actif. Ces molécules peuvent même voir leur activité augmenter en présence de différents activateurs (de façon similaire à la proPO). C’est alors un changement de conformation de l’Hcy qui permet une meilleure accessibilité de son site actif pour les composés phénolés.
3) Les effecteurs immunitaires sont des composés chargés d’inactiver et de détruire le pathogène. Les principaux composés de ce genre décrits dans la littérature sont les peptides antimicrobiens (AMPs) et les enzymes hydrolytiques (Wang et al., 2013b).
– Les peptides antimicrobiens (AMPs) sont caractérisés par leur petite taille (12-100 Aa), leur stabilité à la chaleur, ainsi que leur nature cationique et hydrophobique. Leurs propriétés tensioactives et perforatrices permettent de rompre les membranes des microorga-nismes, ce qui provoque leur lyse (Hooper et al., 2007; Li et al., 2009). Ils sont généralement produits et stockés dans les hémocytes avant d’être libérés plus localement dans une zone infectée ou susceptible de le devenir (Mitta et al., 1999; Zhao et al., 2007). De spécificité faible, ces peptides ont montré des activités anti-bactériennes, antifongiques, et anti-virales ainsi qu’une implication dans la cicatrisation. Les principaux AMPs découverts chez les mol-lusques sont issus de bivalves (e.g. défensines, mytilines).
– Les enzymes hydrolytiques regroupent des protéines responsables de la lyse intra-et/ou extracellulaire (Xue et Renault, 2000) telles que les phosphatases acides et alcalines, les lysozymes, la β-glucuronidase, les estérases, les protéases, les lipases et les amylases (Carballal et al., 1997a; Xue et Renault, 2000; Pipe, 1990; Cima et al., 2000; López et al., 1997a; Matozzo et al., 2007). Ces enzymes ont été détectées dans les hémocytes de nombreux mollusques, ainsi que dans le plasma, mais en quantité moins importante (Carballal et al., 1997a). Elles sont majoritairement stockées dans les lysosomes de ces cellules ou d’organes impliqués dans le système immunitaire.
L’action des lysozymes est fondamentale pour permettre la lyse d’un grand nombre de bactéries. En effet, ces enzymes clivent la liaison 1,4-β-glycosique entre l’acide N-acétyl-muramique et le N-acétyl-glucosamine des parois bactériennes, conduisant à la lyse de la cellule (Herreweghe et Michiels, 2012). Outre cette activité antibactérienne, d’autres fonctions ont récemment été mises en évidence dans le système immunitaire d’invertébrés, comme la modulation de la réponse immunitaire par interaction avec les lectines, certains composés du système du complément, et/ou les POs (Herreweghe et Michiels, 2012; Wang et Zhang, 2010; Rao et al., 2010; Park et al., 2007; Goto et al., 2007).
Chez les céphalopodes, des activités lysozymes ont été mesurées ponctuellement dans l’hémolymphe ou le plasma d’O. vulgaris, en tant qu’indicateur de réponse à un stress (e.g. Grimaldi et al., 2013; Locatello et al., 2013). La seule étude descriptive de la répartition de ces enzymes dans le système circulatoire d’un céphalopode a été réalisée sur l’octopode E. cirrhosa. Ce travail a mis en évidence la présence d’une activité lysozyme au niveau des hémo-cytes, du plasma, ainsi que dans tous les autres organes étudiés (i.e. branchies, corps blancs, cœurs branchiaux et leurs appendices, glandes salivaires ; Malham et al., 1998b). Cependant, aucune réponse claire de cette activité enzymatique en tant qu’effecteur immunitaire n’a pu être soulignée après injection de contaminants ou de bactéries dans le système circulatoire de ces octopodes (Malham et al., 1998b; Grimaldi et al., 2013; Locatello et al., 2013).

La médiation cellulaire

La médiation cellulaire est assurée par les hémocytes, cellules circulant librement dans le plasma ou infiltrées dans les tissus. Alors qu’il est courant de trouver au moins deux popu-lations hémocytaires dans l’hémolymphe des mollusques gastéropodes et bivalves, la grande majorité des études descriptives de ces cellules chez les céphalopodes rapportent un seul type cellulaire (Malham, 1996; Cowden et Curtis, 1981; Rodríguez-Domínguez et al., 2006; Collins et al., 2012). Ces cellules sont impliquées dans de nombreuses fonctions physiologiques chez les mollusques, comme la digestion, le transport et la distribution de nutriments (Beninger et al., 2003), la réparation coquillère et tissulaire (Mount et al., 2004), la détoxication (Ma-tozzo et al., 2001), et la protection de l’organisme vis-à-vis des micro-organismes pathogènes (e.g. Donaghy et al., 2010; Soudant et al., 2013; Rodríguez-Domínguez et al., 2006). Cette der-nière fonction est assurée principalement par les processus de phagocytose, d’encapsulation, et de production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS, autrement appelés radicaux libres), aboutissant à la destruction de l’agent étranger. Le processus de phagocytose, abondamment décrit dans la littérature, se décompose en 4 étapes (Fig. 7.2) :
1. La chimiotaxie, qui correspond à l’attraction et la migration vers un stimulus chimique libéré par l’organisme infecté ou porté par l’agent étranger ;
2. La reconnaissance du corps étranger et son adhésion, qui peut dépendre de certains composés (e.g. lectines), indispensables à ce processus ou permettant simplement de l’améliorer ;
3. L’internalisation du corps étranger par endocytose ;
4. La dégradation intracellulaire.
Le processus d’internalisation conduit à la formation d’un phagosome primaire dans lequel la destruction du micro-organisme a lieu (étape 3). Des lysosomes cytoplasmiques viennent fusionner avec ce phagosome et libèrent leurs enzymes hydrolytiques, contribuant ainsi à la dégradation du composé phagocyté (étape 4). Au cours de l’internalisation du corps étranger, une enzyme membranaire, la NADPH oxydase (Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate oxydase) est activée, provoquant une augmentation de la consommation d’oxygène par la cellule, et la formation directe ou indirecte de ROS, tels que l’anion superoxyde (O2•-), le péroxyde d’hydrogène (H2O2), l’oxygène singulet (1O2), le radical hydroxyle (OH•) ou l’anion hypochlorite (ClO-). Les ROS sont connus pour leurs activités microbicides et agissent seuls ou en synergie avec les enzymes lysosomales (Neumann et al., 2001; Soudant et al., 2013; Di et al., 2013).
Lorsque l’endocytose du corps étranger ne peut avoir lieu, généralement à cause de sa taille, les hémocytes forment une capsule par agrégation autour de ce corps, c’est l’encapsu-lation (étape 3’). Ils la détruisent ensuite par excrétion d’enzymes et de ROS à l’intérieur de cette capsule, c’est la dégradation extra-cellulaire (étape 4’ ; Fig. 7.2).
Chez les céphalopodes, le comportement de phagocytose des hémocytes est connu depuis longtemps (Stuart, 1968; Cowden et Curtis, 1981). Cependant, peu d’études ont décrit ce processus et les paramètres l’influençant (Malham et al., 1997; Castellanos-Martínez et al., 2014; Rodríguez-Domínguez et al., 2006).
Il est possible d’étudier le fonctionnement et le comportement des hémocytes vis-à-vis de différents stimuli à partir de cultures primaires. Cet outil permet de travailler sur cette composante du système immunitaire, isolée de toute interaction avec les autres composantes. Dans le cas des céphalopodes, la culture primaire d’hémocytes représente une alternative intéressante aux expériences d’expositions à des pathogènes in vivo (par balnéation ou in-jection), en raison de la fragilité de ces animaux vis-à-vis des manipulations et de la faible disponibilité en animaux adultes. Dans le cadre de travaux d’écotoxicologie, la culture pri-maire d’hémocytes de céphalopodes s’avère utile pour étudier l’impact direct de différents contaminants sur le comportement de ce type cellulaire (présenté au chapitre 7).

Rappel des connaissances concernant l’écotoxicologie des éléments traces chez la seiche

L’importante capacité d’accumulation des éléments traces par la seiche a été mise en évi-dence dans de nombreuses études (e.g. Miramand et Bentley, 1992; Miramand et al., 2006; Schipp et Hevert, 1978; Bustamante et al., 2006a). Son rôle clé dans les réseaux trophiques marins, en tant que proie d’un grand nombre de prédateurs supérieurs (e.g. oiseaux, mam-mifères) a incité les scientifiques à étudier le métabolisme de cet animal vis-à-vis de ces contaminants.
La plupart des travaux s’intéressant aux concentrations en éléments traces présents dans S. officinalis ont d’abord été réalisés in situ (Miramand et Bentley, 1992; Miramand et al., 2006; Schipp et Hevert, 1978; Bustamante et al., 2006a). Ils ont mis en évidence que le principal organe d’accumulation est la glande digestive, dans laquelle des teneurs très élevées en Ag, Cd, Cu, Fe et Zn ont été mesurées (Miramand et Bentley, 1992; Miramand et al., 2006; Bustamante et al., 2006a). Le rôle des cœurs branchiaux a également été rapporté dans l’accumulation et probablement la détoxication de différents éléments (i.e. Co, Cu, Fe, Ni, V) (Miramand et Bentley, 1992; Schipp et Hevert, 1978). Une étude portant sur l’accumulation de huit éléments chez S. officinalis tout au long de son cycle de vie a montré qu’elle a lieu dès la naissance pour le Cd, le Cu, le Fe, le Pb, le V et le Zn, et dure toute la vie de l’animal. Seule la concentration en Ag dans l’animal diminue à partir de la migration automnale au large (Miramand et al., 2006).
En milieu aquatique, l’assimilation des éléments traces passe par les voies dissoute et tro-phique, dans des proportions différentes en fonction de l’organisme étudié et de la biodisponi-bilité de l’élément dans l’eau et la nourriture (Rainbow, 2002). L’utilisation de radiotraceurs en milieu contrôlé a permis d’estimer les taux d’assimilation pour différents éléments traces chez la seiche adulte et juvénile, à des concentrations environnementales. Cela a permis de mettre en évidence que le Cd, le Co et le Zn sont majoritairement accumulés par la seiche par la voie trophique, alors que l’Ag l’est principalement par la voie dissoute (Bustamante et al., 2004). Ces études ont confirmé le rôle prépondérant de la glande digestive en tant qu’organe d’accumulation, pour ces quatre éléments, et celui des cœurs branchiaux comme probable voie d’excrétion du Co et du Cd (Bustamante et al., 2002b, 2004).
Une fois dans l’organisme, les éléments traces sont « métaboliquement disponibles », au moins jusqu’à ce que des processus physiologiques interagissent pour les excréter ou les lier à une molécule particulière ayant une forte affinité pour l’élément, l’empêchant de se fixer ailleurs (Rainbow, 2002). Ce n’est qu’une fois lié, que l’élément est considéré « détoxiqué » (Mason et Jenkins, 1995). Au sein des invertébrés, la précipitation des éléments traces sous la forme de granules est un mécanisme de détoxication efficace (Marigómez et al., 2002). Ce processus passe par une liaison de ces éléments avec des protéines cytosoliques (i.e. solubles) qui les transportent au niveau de vésicules de stockage (e.g. lysosomes) dans lesquelles leur précipitation peut avoir lieu. L’organisme a ainsi la possibilité de stocker le composé poten-tiellement toxique sous une forme inactive (i.e. insoluble), et éventuellement de l’excréter (Liu et Wang, 2013; Bustamante et al., 2006a; Blackmore et Wang, 2002). Dans la glande digestive de S. officinalis, un type de granules, appelés sphérules, a été décrit au niveau des cellules basales (Fig. 1.7). Les principaux éléments traces détectés dans les sphérules sont le Cu, le Zn, l’Ag, le Ca, le Mg, le Sr et le Pb, associés à du soufre, suggérant l’implication de métallothionéines (MTs) dans ce processus (Martoja et Marcaillou, 1993; Costa et al., 2014). Cependant, l’existence de telles organites (i.e. sphérules) dans les cellules de la glande digestive de S. officinalis reste sujette à controverse (e.g. Bustamante et al., 2006a).
Dans le règne animal, les MTs sont les principales molécules prenant en charge les éléments traces au niveau de la fraction soluble (i.e. cytosolique). Ces protéines de petite taille (10-20 kDa), riches en cystéine, ont une importante capacité à lier les métaux grâce à leurs groupements thiols (–SH ; Fig. 1.13). Elles sont impliquées dans l’homéostasie des métaux essentiels (Cu et Zn) en tant que réservoir pour diverses fonctions métaboliques, ainsi que dans la détoxication d’éléments traces non essentiels (e.g. Hg, Cd, Ag) (e.g. Amiard et al., 2006; Cosson, 1991; Roesijadi, 1992). D’autres molécules ayant des propriétés similaires aux MTs peuvent également avoir un rôle de ligand, comme le glutathion (GSH, sous sa forme réduite) ou les protéines de haut poids moléculaire (HMWP)(Dickinson et Forman, 2002; Serafim et Bebianno, 2010). Afin de déterminer les principaux composants responsables de la prise en charge des éléments traces dans la glande digestive de S. officinalis, le fractionnement subcellulaire de sept éléments traces (i.e. Ag, Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Pb, Zn) issus de seiches adultes prélevées dans le milieu naturel a été estimé (Bustamante et al., 2006a). Ainsi, il a été mis en évidence que l’Ag, le Fe, le Mn, le Pb et le Zn sont majoritairement stockés sous une forme insoluble, confirmant leur détoxication/stockage sous forme de granules et/ou associés aux membranes, tandis que le Cd, le Co et le Cu sont principalement présents dans la fraction soluble, impliquant leurs liaisons avec des protéines cytosoliques. Cependant, peu d’éléments solubles ont montré des liaisons importantes avec des composés de taille similaire aux MTs (Bustamante et al., 2006a).
Les processus de détoxication mis en place par la seiche en cas d’exposition importante à un élément trace restent méconnus. La nature des mécanismes chargés de réguler l’accumu-lation et le fractionnement subcellulaire des éléments traces chez les céphalopodes juvéniles, quel que soit le niveau de maturité de la glande digestive, est également inconnue. Il a cependant été mis en évidence que les paramètres relatifs à l’accumulation (i.e. efficacité d’assimilation et temps de rétention) de certains éléments comme le Co et le Zn présentent des valeurs différentes entre le stade adulte et le stade juvénile. En effet, le Co est assimilé de manière beaucoup plus importante par le juvénile par la voie trophique, tandis que son temps de rétention dans l’organisme est plus long chez l’adulte. En revanche, le temps de rétention du Zn est plus long chez le juvénile (Bustamante et al., 2002b). Ces expériences suggèrent des processus relatifs à la détoxication et à la gestion des éléments traces différents entre ces deux stades de vie (Bustamante et al., 2002b, 2004). En raison du développement important de la glande digestive, et notamment de son système lysosomal, entre la naissance et le premier mois de vie, cette différence de métabolisation peut être liée à la disponibi-lité en ligands spécifiques ainsi qu’à des sites d’accumulation différents, comme déjà suggéré entre Sepiidae et Loliginidae, dont le système lysosomal de la glande digestive est moins développé chez ces derniers (Bustamante et al., 2002a). Il a également été proposé que les différences d’efficacité d’assimilation entre les stades adulte et juvénile peuvent être liées aux natures différentes de la digestion à ces deux périodes (majoritairement extracellulaire vs majoritairement intracellulaire).
Concernant l’étude de la toxicité des éléments traces sur les céphalopodes, les principaux travaux ont été menés sur le stade embryonnaire. Ils ont mis en évidence une toxicité du Cd et du Cu à des concentrations supérieures à 100 µg L-1, se traduisant par la mort de l’embryon (Establier et Pascual, 1983; Sen et Sunlu, 2007). Des expositions prolongées d’œufs de S. offi-cinalis à des concentrations environnementales ont souligné l’importante capacité protectrice de la capsule de l’œuf jusqu’à la fin de l’embryogenèse (i.e. les deux tiers du temps néces-saire au développement). Les propriétés de cette enveloppe changent ensuite et permettent la pénétration de certains éléments (i.e. Ag, Zn, Hg, Mn, Co, Cd, Cs) jusqu’à l’éclosion, avec de potentiels effets délétères sur l’embryon (Lacoue-Labarthe et al., 2008b, 2009d, 2010b). Lacoue-Labarthe et al. (2010a) ont montré une inhibition par le Cd des activités d’enzymes liées à la digestion du vitellus (i.e. les phosphatases acides et les cathepsines), après 18 jours d’exposition à des concentrations supérieures ou égales à 31 ng L-1 (phosphatases acides), et 48 jours d’exposition à 610 ng L-1 (cathepsines). Une potentielle perturbation du système immunitaire (i.e. activités POs) sur ce stade de vie a été également mise en évidence suite à 50 jours d’exposition à 1,2 µg Ag L-1 ou 230 µg Cu L-1 (Lacoue-Labarthe et al., 2009a). Ces études ont souligné l’effet toxique de ces métaux sur le développement et l’immunité de l’embryon malgré la protection des enveloppes de l’œuf. De plus, des pertes de poids des juvéniles à l’éclosion ont été remarquées après 50 jours d’exposition à 0,06 ng Ag L-1, 305 ng Cd L-1 et 23 µg Cu L-1, mettant clairement en évidence une sensibilité importante de ce stade de vie vis-à-vis de ces éléments (Lacoue-Labarthe et al., 2010a). Enfin, il a été récemment montré qu’une exposition pré- et post-éclosion de cet animal à un composé antidépresseur (la fluoxétine) peut perturber le comportement des juvéniles à partir d’une concentration de 1 ng L-1 (Di Poi et al., 2013, 2014).
Ainsi, malgré l’étape critique que représente potentiellement le stade juvénile de S. offi-cinalis et celui d’autres céphalopodes holobenthiques, l’induction de perturbations physio-logiques par les métaux a fait l’objet de peu d’études. Bien que couramment utilisé sur les mollusques bivalves pour étudier l’impact de divers paramètres, le stress oxydatif (déséqui-libre entre les systèmes prooxydants et antioxydants en faveur des premiers, source d’effets toxiques potentiels ; Sies, 1997) commence simplement à être exploré chez les céphalopodes. Seules trois études ont rapporté l’influence de divers paramètres sur les activités d’enzymes impliquées dans la gestion du stress oxydatif sur ces animaux. Il a été mis en évidence que la température d’incubation des œufs, la teneur en oxygène dissous du milieu, et les concentrations tissulaires de différents métaux (i.e. Cd, Cu, Pb, Zn) peuvent induire un stress oxydatif (Rosa et al., 2012; Trübenbach et al., 2013; Semedo et al., 2012). Certains métaux sont connus pour induire directement ou indirectement une production de ROS (e.g. Ag, Cd, Cu, Fe). Cette synthèse ayant lieu dans l’ensemble des cellules des organismes aérobies, de nombreux mécanismes de régulation existent, parmi lesquels 1) l’élimination des catalyseurs de la formation de ROS, et 2) l’élimination des ROS eux-mêmes.
Par exemple, l’enzyme glutathion S-transférase (GST) catalyse la conjugaison du GSH avec des composés électrophiles comme les formes ioniques des éléments traces, empêchant ainsi leur réaction avec d’autres composés cellulaires pouvant induire la formation de ROS (fig. 1.14). Les superoxydes dismutases (SOD) et les catalases agissent en cascade sur deux types de ROS : l’anion superoxyde (O2•-) et le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Les SOD cytosoliques sont des métalloenzymes à Cu et Zn qui catalysent la réduction d’O2•- en H2O2, tandis que les catalases, qui sont des oxydoréductases à quatre hèmes, réduisent l’H2O2 en H2O et O2 (fig. 1.15).
Ainsi, ces deux enzymes permettent de limiter l’interaction de ces radicaux avec d’autres composés (e.g. protéines, lipides, polysaccharides, acides nucléiques). Une surproduction de ROS et/ou une perturbation des systèmes de régulation peut induire une toxicité qui se tra-duit la plupart du temps par des dommages tissulaires, notamment au niveau des membranes biologiques (appelés lipoperoxydation (LPO) ou peroxydation lipidique). Ce phénomène de dégradation est couramment quantifié afin d’estimer le déséquilibre entre actions liées aux ROS et défenses antioxydantes. Chez les céphalopodes, les processus permettant la régulation du stress oxydatif (e.g. GST, SOD, catalase) ainsi que les éventuelles conséquences de ce stress (e.g. LPO) induits par des contaminants n’ont jamais été suivis en conditions contrôlées.

Objectifs de l’étude et organisation du manuscrit

Dans le cadre du projet CHRONEXPO, les travaux effectués pendant cette thèse ont visé à étudier, d’une part, les perturbations physiologiques engendrées par le Zn sur le stade juvénile de la seiche S. officinalis au cours de sa vie côtière, et d’autre part, à développer les connaissances relatives aux cellules responsables de l’immunité chez cet animal, dans le but de mettre en place des tests de toxicité in vitro.
Dans le contexte présenté précédemment, les questions abordées dans cette étude sont les suivantes :
– Quelle est la sensibilité du stade juvénile de Sepia officinalis vis-à-vis du Zn dissous ?
– Quelles sont les perturbations induites par le Zn dissous à des concentrations non lé-tales sur le développement du juvénile exposé un à deux mois ? La maturation de la glande digestive induit-elle des modifications de sensibilité et/ou de régulation du Zn ? Le système immunitaire est-il affecté ? Certains marqueurs sont-ils plus pertinents ?
– L’accumulation du Zn dissous par la seiche juvénile peut-elle induire une modification de l’homéostasie métallique globale ? Les MTs sont-elles impliquées dans cette gestion à ce stade de vie ? L’exposition au Zn induit-elle un stress oxydatif ? Si oui, à quel niveau et par quel mécanisme?
– Dans quelle mesure est-il possible de réaliser une contamination trophique prolongée ?
– Quelle est la formulation hémocytaire de S. officinalis ? Est-il envisageable d’utiliser ces cellules dans le cadre d’études in vitro, notamment en écotoxicologie ?
Ce manuscrit sera organisé de la façon suivante :
1. La partie II présente un travail préliminaire qui nous a permis de mieux appréhender le rôle de trois enzymes classiquement utilisées pour étudier le système immunitaire des invertébrés (i.e. les phénoloxydases, lysozymes et inhibiteurs de protéases) chez la seiche.
2. La partie III développe l’étude des effets toxiques du Zn sur différents processus physio-logiques du juvénile :
– Le chapitre 3 décrit les travaux menés afin d’estimer la sensibilité de ce stade de vie vis-à-vis du Zn et d’étudier de potentiels impacts, létaux ou non, d’expositions pro-longées sur la croissance, le comportement, et les systèmes immunitaires et digestifs ;
– Le chapitre 4 s’intéresse à l’impact d’expositions d’une durée de un à deux mois, à des concentrations non létales en Zn, sur l’homéostasie des métaux dans les juvéniles, le stress oxydatif et la synthèse de MTs ;
– Le chapitre 5 présente des essais préliminaires d’élevage et d’accumulation du Zn dans un crustacé adapté à l’alimentation des premiers stades de vie du juvénile de seiche.
3. La partie IV rapporte les études menées sur la composante cellulaire du système immu-nitaire de Sepia officinalis :
– Le chapitre 6 présente la caractérisation des hémocytes de seiche ;
– Le chapitre 7 décrit les essais de mise en culture des hémocytes et la réalisation de quelques tests de toxicité.

Table des matières

I Introduction 
1 Introduction
1.1 Contexte et présentation du projet CHRONEXPO
1.1.1 Contexte scientifique
1.1.2 Présentation du projet CHRONEXPO
1.2 Le zinc
1.2.1 Généralités
1.2.2 Principales fonctions
1.2.3 Toxicité et réglementation en milieu aquatique
1.3 Le modèle biologique : la seiche commune Sepia officinalis
1.3.1 Généralités
1.3.2 Le système digestif de Sepia officinalis
1.3.3 Le système circulatoire et l’immunité des céphalopodes
1.3.4 Rappel des connaissances concernant l’écotoxicologie des éléments traces chez la seiche
1.4 Objectifs de l’étude et organisation du manuscrit
II Distribution du système prophénoloxydase, des lysozymes et des inhibiteurs de protéases dans les tissus de la seiche commune Sepia officinalis 
2 Prophenoloxidase system, lysozyme and protease inhibitor distribution in the common cuttlefish Sepia officinalis
2.1 Introduction
2.2 Material and methods
2.2.1 Animals and tissue samples
2.2.2 Chemicals
2.2.3 Enzyme extraction
2.2.4 Biochemical analysis
2.2.5 Statistical analysis
2.3 Results and discussion
2.3.1 APO- and PO-like activity distribution and potential functions
2.3.2 Lysozyme distribution
2.3.3 PI distribution
III Etude des effets d’expositions prolongées au zinc sur la physiologie du stade juvénile de la seiche commune Sepia officinalis au cours de sa vie côtière 
3 Physiologicalperturbations injuvenile cuttlefish Sepia officinalis induced
by subchronic exposure to dissolved Zn 71
3.1 Introduction
3.2 Materials and methods
3.2.1 Animals
3.2.2 Experimental design
3.2.3 Predatory behavior study
3.2.4 Enzymatic assays
3.2.5 Chemicals
3.2.6 Statistical analysis
3.3 Results
3.3.1 Zn measurements in seawater
3.3.2 Mortality
3.3.3 Predation behavior
3.3.4 Enzymatic responses to Zn exposure in juvenile
3.3.5 Zn exposure impacts on juvenile cuttlefish growth
3.4 Discussion
3.4.1 Mortality
3.4.2 Predatory behavior impairment
3.4.3 Digestive system perturbations
3.4.4 Immune system perturbations
3.4.5 Growth loss induced by Zn exposures
3.5 Conclusions
4 Metal homeostasis in the juvenile cuttlefish Sepia officinalis and consequences of dissolved zinc exposure
4.1 Introduction
4.2 Materials and methods
4.2.1 Animals
4.2.2 Experimental design
4.2.3 Subcellular fractionation and MT determination
4.2.4 Trace element analysis in respective soluble and insoluble fractions
4.2.5 Biochemical analysis
4.2.6 Statistical analysis
4.3 Results
4.3.1 Trace metal homeostasis in juvenile cuttlefish
4.3.2 Zn exposures
4.4 Discussion
4.4.1 Metal homeostasis in juvenile cuttlefish
4.4.2 Zn exposures
5 Essais et limitesd’une contaminationtrophique
5.1 Choix de la proie
5.2 Description de l’espèce choisie
5.3 Description du système d’élevage
5.3.1 Structure d’élevage
5.3.2 Conditions d’élevage
5.3.3 Suivis
5.3.4 Bilan concernant l’élevage de N. integer
5.4 Contamination au Zn de Neomysis integer
5.4.1 Résultats et discussion
5.4.2 Bilan et perspectives
IV Caractérisation des hémocytes de Sepia officinalis et développement de leur culture primaire dans le but de réaliser des tests de toxicité in vitro 
6 Hemocytemorphology and phagocytic activity in the common cuttlefish (Sepia officinalis)
6.1 Introduction
6.2 Material and methods
6.2.1 Animals
6.2.2 Hemolymph collection
6.2.3 Chemicals
6.2.4 Morphological characterization of S. officinalis Hcs
6.2.5 Biochemical analysis
6.2.6 Flow cytometry (FCM) analysis
6.2.7 Data analysis
6.3 Results and Discussion
6.3.1 Hc viability and concentration
6.3.2 Hc identification and characterization
6.3.3 Enzymatic assays
6.3.4 FCM analysis
6.4 Conclusions
7 Développement et utilisation des hémocytes deseicheen conditionsin vitro pour des études en écotoxicologie
7.1 Introduction
7.2 Matériels et méthodes
7.2.1 Prélèvement d’hémolymphe et mise en culture
7.2.2 Effet des paramètres de culture sur la viabilité
7.2.3 Effet des paramètres de culture sur la viabilité
7.2.4 Analyse des données
7.3 Résultats et discussion
7.3.1 Effet du milieu de culture et de la température
7.3.2 Effet du Cd et du Zn sur la phagocytose et la production de ROS
V Conclusion générale – perspectives 
8 Conclusion générale -perspectives
8.1 Effets du Zn sur le stade juvénile de S. officinalis
8.2 Caractérisation des hémocytes de S. officinalis et développement de leur culture primaire
Références bibliographiques 
ANNEXES 

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