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Composants hétérosidiques de Sigesbeckia orientalis
Lors de la photosynthèse des plantes, les premiers corps produits sont des Glucides (hydrate de carbone ou carbohydrate) de formule générale C n(H20) n, qui représente le groupe le plus important des éléments plastiques et énergétiques des végétaux et de leurs substances de réserve. Ces glucides sont divisés en OSES (sucres simples) et en OSIDES (sucres réducteurs). Les holosides sont formés uniquement par des oses, les hétérosides sont composés d’un ou de plusieurs oses et d’une substance non glucidique appelée « génine » ou « aglycone » (PARIS & MOYSE, 1965).
Plus précisément, les hétérosides résultent de la combinaison, avec élimination d’une molécule d’eau, du groupe réducteur d’un ose avec la substance non glucidique nommée aglycone ou génine. Ce sont des composés très répandus chez les végétaux et qui constituent les principes actifs de beaucoup de plantes médicinales, d’où leur importance en matière médicale (PARIS & MOYSE, 1965).
Les principaux constituants des parties aériennes du Sigesbeckia orientalis extractibles par des solvants sont des métabolites secondaires appartenant à la classe des Terpénoïdes dont le principal représentant est le Darutoside (diterpène glycoside) (Figure 2). Il est isolé au début du 19ème Siècle et il contribue aux propriétés cicatrisantes de la plante. Grâce à ce Darutoside, les feuilles de Sigesbeckia orientalis renferment une importante gomme-résine qui est notamment employée dans le traitement des dermatoses et des brûlures (www.goodguide.com, 2016).
L’alpha hédérine (α-H) (Figure 3) est utilisé comme marqueur et standard de référence pour repérer le Darutoside (principe actif de Sigesbeckia orientalis). La ligne de migration du Darutoside se trouve très proche de celle du standard (α-H). Autrement dit, les Rf (Right flow
Matériels et méthodes
indique la migration distance qui est la division entre la hauteur du pic et le front du solvant) du Darutoside et du standard α-H sont presque identiques (LAVENIR & FAUGERA, 1965).
Etudes préliminaires
Etude bibliographique
L’étude bibliographique permet d’avoir des informations préliminaires sur l’espèce Sigesbeckia orientalis, comme la description botanique de l’espèce, sa préférence écologique et sa classification. Elle a permis aussi de faire le choix du site d’étude. Des renseignements nécessaires pour l’étude chimique ont été rassemblés aussi lors de cette étude bibliographique.
Prospection du site d’étude
Pour le choix de la méthode adéquate et pour la collection des matériaux nécessaires sur terrain, une prospection du site est indispensable.
Consultation des spécimens d’herbier
Les herbiers informent quant à la morphologie de l’espèce Sigesbeckia orientalis, sa classification, ses noms vernaculaires, et les lieux où on peut la rencontrer.
Collecte des données
Les données brutes proviennent d’échantillons collectés et analysés selon le cheminement suivant:
– Récolte des échantillons de plantes et de sols dans la commune d’Anjiro et ses environs.
– Analyse des échantillons de plantes conférée au laboratoire phytochimique, de la société SOTRAMEX à Antananarivo qui a adopté le même protocole d’analyse qu’Yves Rocher.
– Analyse pédologique réalisée au laboratoire du FOFIFA Tsimbazaza Antananarivo.
Récolte des échantillons de plantes :
Afin de répondre aux hypothèses présentées en introduction, il a été nécessaire de cueillir les échantillons de plantes à différentes périodes de l’année, c’est-à-dire au début de la période de pluie (mois de décembre), à la période de fortes précipitations (fin du mois de janvier) et à la fin de la période pluvieuse (mois de mars). De préférence, les échantillons de feuilles, plantes entières, et graines, ont été récoltés; la disponibilité des organes lors de la période de récolte détermine ce choix.
La cueillette des plantes a été faite dans les Communes suivantes : Ambohidronono, Anosibe Ifody, Belavabary, Sabotsy Anjiro et Vodirina.
Conditions de sélection des échantillons soumis à l’analyse : des plantes saines (dépourvues de champignons ou moisissures), de couleur verte (les bourgeons foliaires et vieilles feuilles ne sont pas cueillis) (Photo 3).
Séchage des échantillons de plantes collectés
Les échantillons collectés ont été séchés de trois façons différentes :
– Séchage par la technique de la lyophilisation : technique de séchage qui consiste à
éliminer l’eau d’un produit par congélation rapide suivi d’une sublimation de la glace formée, jusqu’à complète dessiccation (www.larousse.fr, 2015). L’étude est réalisée à l’aide d’un lyophilisateur. (Photo 4).
– Séchage solaire : exposer les échantillons (feuille ou plante entière ou graine de Sigesbeckia orientalis) dans un milieu sec, aéré et ensoleillé.
– Séchage à l’ombre : mettre les échantillons à l’abri du soleil mais dans un milieu bien aéré et sec.
Les échantillons de plantes de Sigesbeckia orientalis (feuilles, plantes entières et graines) collectés dans chaque commune ont été subdivisés pour ces trois modes de séchage.
Le codage est fait avec mention de l’origine de l’échantillon aux fins de traçabilités. Exemple : SOR 1510-An F/S: échantillon de Sigesbeckia orientalis de l’année 2015, prélevé à la 10ème semaine, collecté à Anjiro (An), mention du type d’organe : F pour feuille et mode de séchage : S pour solaire.
Tous les échantillons cueillis, correspondant aux différents modes de séchage, ont été stockés dans différents sacs pendant une durée maximum de 3h. Le protocole suivant a été adopté suivant le mode de séchage choisi :
– Les échantillons ayant subis un séchage au soleil ont été étalés sur une bâche dans un endroit ensoleillé et bien aéré jusqu’à contexture craquante. Au coucher du soleil, quand ils ne sont pas encore suffisamment secs, ils ont été ramassés avant d’être étalés une seconde fois le lendemain, et ainsi de suite ;
– Les échantillons ayant subis un séchage à l’ombre ont été étalés, jour et nuit, sur une bâche,
dans une chambre bien aérée mais à l’abri du soleil, jusqu’à l’état sec ;
– Les échantillons ayant subis une lyophilisation ont été stockés dans un congélateur jusqu’au
moment de la lyophilisation
Extraction des échantillons séchés de Sigesbeckia orientalis
Afin d’obtenir des extraits secs pour la chromatographie sur couche mince, nous avons suivi le protocole suivant (Figure 4):
1- Mesurer l’humidité de l’échantillon
Le test préalable est manuel : seuls les échantillons qui se craquent après une légère pression manuelle sont considérés comme échantillons secs (Photo 5). La mesure de l’humidité résiduelle d’un échantillon requiert l’utilisation d’un dessiccateur halogène (Sartorius). Seuls ceux qui possèdent un taux d’humidité <10% sont considérés comme sec.
2- Mélanger 10g de plantes sèches broyées et mises en suspension dans 100cc d’Ethanol/eau 40%
3- A l’aide d’une rampe d’extraction, soumettre le mélange à reflux pendant 1h et sur une plaque chauffante avec agitation magnétique, pour l’extraction des échantillons.
4- Filtrer à chaud.
5- Evaporer à sec en utilisant un évaporateur rotatif.
A la fin de l’extraction, l’extrait se présente sous forme d’une cire collante, qu’il convient de décoller des ballons et peser à l’aide d’une balance de précision. Chromatographie sur couche mince de l’extrait sec Afin de repérer les différents composants chimiques contenus dans l’espèce Sigesbeckia orientalis, la méthode de chromatographie sur couche mince a été utilisée. Cette dernière permet la séparation des différents constituants d’un mélange, basée sur la différence d’adsorption de différentes molécules sur une phase fixe de silice activée (TLC Silica gel 60F254) lors de l’élution des plaques par une phase mobile (JORK & al., 1990). Plusieurs étapes ont été suivies (Figure 5):
1- Mélanger 0,1g d’extrait sec avec 20cc d’éthanol 50%
2- Usage du DEPOSEUR CAMAG TLC SAMPLER 4
Après paramétrage de l’ordinateur, procéder au dépôt automatique de 10µl de chacun des échantillons de Sigesbeckia orientalis et 10µl du standard alpha Hédérine (α-H) sur la plaque chromatographique en place.
3- Après son retrait de l’appareil, la plaque est séchée à 110°C sur une plaque chauffante régulée, pendant quelques minutes, pour faire évaporer le solvant (éluant).
4- Placer ensuite la plaque dans une cuve d’élution pour balayage progressif ascendant par la phase mobile : cette phase est une phase ternaire de chloroforme/Méthanol/Eau 65 :25 :4 (v/v/v) contenant 65ml de chloroforme, 25ml de Méthanol et 4ml d’eau.
5- Evaporation de la phase ternaire à 110°C sur la plaque régulée.
6- Révéler celle-ci par une solution d’acide sulfurique (5ml d’acide sulfurique concentré qsp 100ml Ethanol 96%).
7- Sécher à 110°C sur une plaque chauffante pour la lecture des spots.
Lecture des résultats issus de la chromatographie sur couche mince :
Le résultat de la CCM est interprétable en lumière visible et sous scanner
– Lecture en lumière visible
La présence du Darutoside de l’espèce Sigesbeckia orientalis peut être appréciée dans chaque échantillon. Les spots des molécules migrées de tous les composés chimiques dans l’espèce sont visibles. Le Rf de migration du Darutoside est très proche de celui de l’alpha-Hédérine (α-H) de référence (le Rf Right flow qui est la migration distance, est le rapport entre la hauteur du pic et le front du solvant). Darutoside et standard α-H sont presque identiques (LAVENIR & FAUGERA, 1965).
– Lecture de la plaque CCM sous scanner : CAMAG TLC scanner 3 (Photo 6) Afin de quantifier la concentration des composés chimiques contenus dans chaque échantillon, on procède à la lecture des taches visible sur la plaque CCM, en utilisant un scanner. Cet appareil permet la traduction des surfaces et des hauteurs de pics d’absorption en des courbes et Tableaux (catalogue international 2013). Ainsi la quantification de la variation
Table des matières
Liste des Figures
Liste des Photos
Liste des Tableaux
Liste de Carte
Liste des Annexes
Abréviations et acronymes
INTRODUCTION
I. MILIEU D’ETUDE
I.1 Situation géographique
I.2 Milieu abiotique
I.3 Milieu biotique
I.3.1 Végétation et flore
I.3.2 Faune
I.3.3 Population et ses activités
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 Matériels biologiques
II.1.1 Description de Sigesbeckia orientalis L
II.1.2 Composants hétérosidiques de Sigesbeckia orientalis
II.2 Méthodes
II.2.1 Etudes préliminaires
II.2.1.1 Etude bibliographique
II.2.1.2 Prospection du site d’étude
II.2.1.3 Consultation des spécimens d’herbier
II.2.2 Collecte des données
II.2.2.1 Récolte des échantillons de plantes
II.2.2.2 Séchage des échantillons de plantes collectés
II.2.2.3 Extraction des échantillons séchés de Sigesbeckia orientalis
II.2.2.4 Chromatographie sur couche mince de l’extrait sec
II.2.2.5 Analyse pédologique
II.2.2.6 Autres paramètres relatives aux sites de récoltes
II.2.3 Analyse et traitement statistiques des données collectées
II.2.3.1 Analyse de variance (ANOVA)
II.2.3.2 Analyse en composantes principales (ACP)
III. RESULTATS ET INTERPRETATIONS
III.1 Echantillons collectés
III.2 Séchages des échantillons collectés et codages
III.3 Résultat d’extraction
III.4 Analyse chromatographique sur couche mince
III.4.1 Lecture visible
III.4.2 Lecture sous scanner
III.5 Résultats de l’analyse pédologique
III.6 Résultats de relevé des autres paramètres
III.7 Détermination des conditions favorables pour une meilleure teneur en Darutoside
III.7.1 Variation de la teneur en Darutoside selon le type d’organe et le séchage
III.7.2 Variation de la teneur en Darutoside selon les périodes de récolte
III.7.3 Variation de la teneur en Darutoside selon les caractéristiques de l’habitat
IV. DISCUSSIONS
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
WEBOGRAPHIE
ANNEXES
