BIOLOGICAL METHOD (ELISA) TO DETECT RESIDUES OF NICARBAZINE IN EGGS

Contexte

La nicarbazine est un médicament vétérinaire de la famille des anticoccidiens. Ce principe actif est utilisé chez la volaille pour lutter contre les coccidioses, en supplémentation dans les aliments. Son utilisation est interdite chez les poules pondeuses. Toutefois, une contamination croisée des aliments pour la volaille lors de leur production peut entrainer la présence de résidus de nicarbazine dans les œufs. La nicarbazine possède un Niveau d’Action Différentiel (NAD) de 100 µg/kg. Nous avons donc utilisé cette limite comme la cible à atteindre par la méthode validée ici. La nicarbazine est un mélange équimolaire de 4,4-dinitrocarbanilide (DNC) et de 2-hydroxy-4,6 diméthyl pyrimidine (HDP). Le résidu marqueur est le DNC. Donc, comme dans la plupart des méthodes analytiques publiées, c’est le DNC qui était recherché dans les œufs, par le test ELISA sélectionné (CER, Belgique).

Méthodologie/Principaux résultats

Nous avons tout d’abord validé cette méthode selon la décision européenne 2002/657/CE [13]. Nous avons déterminé les caractéristiques de performance de la méthode selon cette décision, c’est-à-dire selon une approche « critère par critère ». L’objet de cet article est de montrer qu’à partir des résultats obtenus lors de la validation, nous pouvons aussi analyser les mêmes données grâce à une approche globale, c’est-à-dire selon une approche basée sur l’erreur totale et le profil d’exactitude. Nous pourrons ainsi conclure sur les performances de la méthode, en utilisant une autre approche et comparer les conclusions des deux approches quant aux performances de la méthode. Dans un premier temps, pour construire le profil d’exactitude, nous avons analysé 6 standards d’étalonnage en tampon fournis avec le kit (0,2 ; 0,5 ; 2 ; 5 ; 10 et 20 µg/L). Six séries d’analyse ont été réalisées et chaque standard d’étalonnage a été analysé en double. Le nombre total de standards d’étalonnage était de 72, ce qui est suffisant pour établir la fonction de réponse. En effet, pour construire un modèle d’étalonnage logistique à 4 paramètres, il faut un minimum de 5 niveaux de concentration. De plus, 3 standards de validation (70, 140 et 210 µg/kg) dans les œufs ont été analysés. Après l’étape d’extraction des œufs, les extraits étaient dilués au 1/10 pour obtenir des niveaux de concentration rentrant dans le domaine couvert par la gamme d’étalonnage. Six séries d’analyse ont été réalisées et chaque standard de validation a été analysé en triple. Un total de 54 standards de validation a permis d’établir le profil d’exactitude. Nous avons alors procédé à une analyse quantitative des résultats. Dans un deuxième temps, nous avons analysé 52 échantillons d’œufs blancs (sans résidus de nicarbazine) et 40 échantillons d’œufs supplémentés à 70 µg/kg en DNC. Nous avons alors effectué une analyse qualitative des résultats. Pour cela, nous avons fixé une valeur seuil, en utilisant la valeur du percentile 95, c’est-à-dire la valeur pour laquelle 95 % des échantillons sont en dessous. Audessus de cette valeur seuil, les échantillons sont considérés négatifs et inversement.Nous avons analysé les résultats de validation grâce au logiciel e.noval, version 2.0. Nous avons utilisé différents indices qui reflètent les caractéristiques majeures de validation, pour sélectionner le meilleur modèle de fonction de réponse. Ces indices ont été définis dans un article de Rozet et al. . Le Tableau 19 résume les différents indices obtenus pour les différents modèles testés. En ce qui concerne l’indice d’exactitude IA, qui est un indicateur global de la performance de la méthode, les meilleur indices sont obtenus pour les régressions quadratiques avec ou sans pondération. Toutefois, les valeurs d’indices sont basses et reflètent une grande variabilité et un manque de justesse. La meilleure valeur de justesse (IT), parmi les 3 modèles précédemment cités, a été obtenue avec le modèle quadratique non pondéré, alors que les meilleurs indices d’exactitude et de fidélité ont été obtenus avec le modèle quadratique pondéré (1/X2 ). Ce résultat montre que l’indice d’exactitude IA seul ne peut servir au choix du modèle le mieux adapté. Dans le meilleur des cas (modèle quadratique pondéré (1/X2 )), seul 70% de l’intervalle de dosage est valide. L’indice de fidélité IP le meilleur a été obtenu pour le modèle quadratique pondéré (1/X2 ). Cependant, la variabilité pour ce modèle à la concentration la plus basse est très élevée (23,62 % en fidélité intermédiaire). Pour les 3 modèles retenus plus haut, la répétabilité est conforme aux critères de la décision 2002/657/CE [13], mais pas la fidélité intermédiaire pour cette concentration. La répétabilité et la fidélité intermédiaire sont conformes aux critères réglementaires aux concentrations plus élevées. Le manque de justesse vient probablement d’un effet matrice. Pour résoudre ce problème de justesse et de fidélité, trois solutions ont été testées. Premièrement, les valeurs de concentrations ont été corrigées par un coefficient de correction. Le modèle corrigé est présenté dans la Figure 47. Dans ce cas, l’indice de justesse était de 1 mais la fidélité était moins bonne à tous les niveaux. La seconde solution était de travailler dans un intervalle de dosage plus restreint, de 14 à 21 µg/kg sans correction. Dans ce cas, le meilleur modèle était la régression quadratique pondérée (1/X) (Figure 46). La troisième solution était d’utiliser la méthode seulement comme une méthode qualitative, grâce à la valeur seuil déterminée à 20 µg/kg, ce qui est acceptable en regard du Niveau d’Action Différentiel (NAD) de 100 µg/kg. Cette valeur seuil correspond à un taux de faux-négatif inférieur ou égal à 5 %, comme exigé dans la réglementation européenne. Le taux de faux-positifs à cette valeur est de moins de 1 %. Il est impossible de comparer nos résultats issus de l’approche globale avec ceux de la validation de ce même kit réalisée par Huet et al. selon une approche critère par critère [319]. En effet, la méthode a été validée uniquement comme une méthode qualitative. Les auteurs avaient rapporté une capacité de détection CCβ inférieur à 3 µg/kg dans les œufs.

Conclusions/Importance

Nous avons pu analyser les données de validation du kit ELISA pour le dépistage de la nicarbazine dans les œufs, grâce à l’approche basée sur l’erreur totale et le profil d’exactitude. Les conclusions de l’approche globale sont que cette méthode ne peut être utilisée comme une méthode quantitative, en raison de son manque de justesse et de fidélité, dans l’intervalle de dosage qui nous intéressait. Cette méthode doit donc être utilisée seulement comme une méthode qualitative, ce qui est suffisant pour une méthode de dépistage. Cette étude a permis de conclure sur les performances de la méthode, en utilisant une nouvelle approche d’exploitation des données. Quand nous avions validé ce kit selon la décision européenne 2002/657/CE, l’analyse qualitative des données avait montré une différence significative entre les œufs blancs et les échantillons supplémentés à 0.7*NAD. La capacité de détection était donc bien inférieure au NAD pour les œufs. Aucun résultat faux-positif, ni aucun résultat faux-négatif au niveau du NAD n’avait été obtenu. Donc les résultats étaient aussi satisfaisants au niveau qualitatif. Le kit avait montré une grande spécificité pour la nicarbazine. Il ne reconnaissait pas les grandes familles d’antibiotiques et reconnaissait très faiblement d’autres coccidiostatiques (réactions croisées 0.008 % à 0.025 %). Concernant l’analyse quantitative, les coefficients de variation (CV) intra-jour étaient compris entre 11.2 et 27.6% et les CV inter-jours entre 25.5 et 33.9 %. Donc, les conclusions de cette approche étaient similaires à celle de l’approche globale, c’est-à-dire que la méthode ne devrait pas être utilisée comme une méthode quantitative, étant donné les problèmes de répétabilité et surtout de fidélité intermédiaire. De plus, nous avions aussi conclu que la justesse n’était pas satisfaisante (comprise entre 48 et 67%). Donc, l’approche critère par critère et l’approche globale du profil d’exactitude conduisent à la même conclusion, c’est-à-dire qu’il faut utiliser ce kit ELISA uniquement pour le dépistage qualitatif de la nicarbazine dans les œufs et non pour des analyses quantitatives. L’avantage du profil d’exactitude est de pouvoir comparer plusieurs modèles rapidement grâce au logiciel d’analyse des données et de visualiser graphiquement les problèmes de justesse et de fidélité, en fonction des concentrations. De plus, même si cela n’a pas fonctionné dans ce cas, il est possible grâce à un facteur de correction de corriger des effets matrices pour améliorer la justesse d’une méthode.