Comparatif de réactifs de dissociation cellulaire

Pour trouver des pistes d’amélioration de nos procédures de culture j’ai analysé les effets de différents réactifs de culture cellulaire sur la morphologie, le taux de croissance, l’expression des PAL et des facteurs de transcription Nanog, Oct4 et Sox2. J’ai testé différents réactifs de dissociation cellulaire, des milieux sans sérum (DKO+KSR+LIF et 2i+LIF) et des nouvelles lignées de cellules ES. Nous avons constaté à plusieurs reprises des différences d’activité protéolytique entre plusieurs lots de trypsine. Certains lots plus actifs ont conduit à la différenciation de nos cellules ES et à une chute de leur croissance de manière ponctuelle. J’ai donc voulu comparer plusieurs réactifs de dissociation cellulaire pour évaluer leur impact sur nos cellules ES (tableau n°4).

 Dosage des PAL

Compte tenu de la localisation extracellulaire des PAL (ancrées dans la membrane cytoplasmique par des GPI) et de leur forte représentation chez les cellules ES, je me suis demandé si l’activité protéolytique des réactifs de dissociation était observable par le dosage des PAL membranaires résiduelles (figure n°31). J’ai comparé différents réactifs de dissociation cellulaire afin de le déterminer (Tableau n°4). L’objectif de ce test est de choisir le réactif qui dissocie correctement nos cellules ES avec une activité protéolytique minimale. Comparatif de réactifs de dissociation cellulaire 60 Figure n°31 : Détection des PAL après utilisation de différents réactifs de dissociation cellulaire Les données présentées sont les moyennes de cinq dosages indépendants. Chaque dosage a été réalisé après culture des cellules ES de la lignée JM8.F6 pendant six jours en milieu DKO+LIF (n=3) et 2i+LIF (n=4). Pour chaque condition « n » représente le nombre de culture de cellules ES analysés. Chaque culture est indépendante. Sur les cultures en DKO+LIF nous n’observons pas de différence, mais en milieu 2i+LIF lorsque les amas cellulaires sont dissociés avec le réactif sans enzyme (GCDR) la concentration en PAL est deux fois plus élevée (125,5 ng/mL) que celles obtenues avec les réactifs enzymatiques Accutase et trypsine n° 1788056 (58,7 ng/mL). Les différences observées entre le GCDR et les réactifs enzymatiques sont toutes significatives (p value comprises entre (0,05 > p > 0,009). Il n’y a pas de différence significative entre les quatre réactifs enzymatiques testés (p > 0,27). Le GCDR n’a pas d’activité enzymatique et dénature donc moins les protéines membranaires dont celles d’adhésion cellulaire. Compte tenu de la forte adhérence des cellules ES entre elles, la dissociation est essentiellement mécanique, ce qui fait chuter la viabilité cellulaire de 40% par rapport à une dissociation enzymatique. Par conséquent nous ne pourrons pas utiliser ce réactif pour la culture des cellules ES. Les quatre réactifs enzymatiques testés laissent moins de PAL à la surface des cellules que le GCDR. Cela confirme que ces réactifs enzymatiques dégradent les PAL. Aucune différence significative n’étant observée entre les différents réactifs enzymatiques, ce dosage ne nous donne aucun indice sur l’activité protéolytique des réactifs de dissociation.

Taux de croissance

Nous avons constaté par nos observations morphologiques que l’Accutase et la trypsine du lot n°1788056 avaient moins d’impact sur la viabilité cellulaire que le lot de trypsine n° 1722774. J’ai quantifié cette différence en comparant les taux de croissance obtenus après utilisation de ces différents réactifs sur des cultures de la lignée JM8.F6 réalisées en milieu 2i+LIF. Figure n°32 : Taux de croissance obtenus après dissociation cellulaire Les taux de croissance présentés correspondent à des cultures de cellules ES JM8.F6 cultivées en milieu 2i+LIF pendant 5 à 9 jours avant leur micro-injection. Pour chaque réactif « n » représente le nombre de clone de cellules ES analysés. La culture de chaque clone est indépendante. Les cellules ES dissociées avec l’Accutase ont un taux de croissance moyen de 5,3, alors que ceux des cellules ES traitées avec les lots n°1788056 et 1722774 de trypsine sont respectivement de 4 et 3,7. Les différences de 30% observées entre l’Accutase et les deux lots de trypsine sont significatives (p « Accutase/T1722774 »=0,002 et p « Accutase/T1788056 »=0,0002), mais celle observée entre les deux lots de trypsine ne l’est pas (p=0,48). Cette différence est surement due à la spécificité de chaque réactif : la trypsine coupe toute les séquences peptidiques qui contiennent des résidus d’Arginine et de Lysine, alors que l’Accutase serait plus spécifique. L’Accutase est un mélange de plusieurs enzymes pourvues d’activités protéolytiques et collagénolytiques, dont la composition est protégée par un brevet. Ce mélange d’enzymes a été initialement créé pour obtenir des suspensions de cellules individualisées pour les besoins de la cytométrie en flux. Compte tenu de l’importance de conserver l’intégrité des molécules membranaires pour les immunomarquages, l’Accutase dégrade peut les molécules membranaires dont certains récepteurs impliqués dans différentes voie métaboliques tels que l’EGFR ou le FGFR. Cela pourrait expliquer pourquoi nous obtenons un taux de croissance supérieur en utilisant l’Accutase.