CONSERVATION DES SOUCHES BACTERIENNES

Les souches bactériennes exigeantes comme leur nom l’indique, sont difficiles à conserver et nécessitent des milieux de conservation particuliers qui tiennent compte de leur exigence. Exemples : – Haemophilus influenzae : Nous pouvons le conserver sur : – Bouillon MH+ sang de mouton à 5% +glycérol à 10%, – BCC+ glycérol à 25 % + lactose à 6 % – GSC+Polyvitex (en pente). – MGY – Streptococcus pneumoniae – BCC+glycérol à 25 % + lactose à 6 % – Bouillon MH+ sang de mouton à 5%+glycérol à 10%, – GSC+ gentamicine (en pente) – MGY  Ce travail a pour cadre d’étude l’unité de recherche et de biotechnologie microbienne du laboratoire de Bactériologie-Virologie de l’hôpital Aristide Le Dentec.

Les souches bactériennes 

Notre étude a porté sur des souches de Streptococcus pneumoniae et d’Haemophilus influenzae. Les souches de références utilisées sont de type American Type Culture Collection (ATCC). Il s’agit de : -Haemophilus influenzae ATCC 49247 -Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 I-3 / Matériel pour l’isolement et l’identification des souches : – Anse de platine – Autoclave – Bec Bunsen – Boîtes de Pétri – Bougie ou générateur de CO2 – Désoxycholate de sodium 10% – Disques d’optochine – Gélose Columbia – Sang de cheval – Polyvitex – Disques d’oxydase – Ecouvillons stériles – Etuve à 37°C Matériel et Méthodes 22 – Gélose trypticase – soja – la gélose de Wilkins-Chalgren – Isovitalex – Jarre d’incubation – Lames porte – objet – Pipettes – Embout – Microplaques CSB – Microscope optique – Peroxyde d’hydrogène à 3 % – Pipettes pasteur – Sang de cheval – Violet cristal – Alcool 95 ° ou 96° – Eau du robinet – Lugol – Fuchsine – Echelle de McFarland – Huile d’immersion. I-4 / Matériel pour la conservation des souches : – Lait écrémé – Lactose – Glucose – Extrait de levure – Glycérol – BCC Matériel et Méthodes 23 – Tubes Nuncs . 

Milieux de culture pour l’isolement et l’identification des souche

Gélose trypticase-

soja + sang de cheval • Milieu de base : gélose trypticase- soja Peptone trypsique -15g Peptone papainique de soja 5g Chlorure de sodium 5g Agar -15g Dissoudre le mélange dans un litre d’eau distillée stérile puis autoclaver à 1 21°C pendant 15 mn. • Milieu complet : GSC Ajouter à la gélose trypticase – soja préalablement refroidie à environ 70° C, 5 à 10% de sang (5 ml de sang de cheval pour 100 ml de milieu). NB : on peut utiliser indifféremment du sang stérile de cheval ou de mouton ; cependant les zones d’hémolyse chez S.pneumoniae sont souvent plus nettes sur la gélose au sang de mouton.

GSC + Polyvitex

Milieu de base : GSC Ajouter le Polyvitex / 100ml de base. Le milieu obtenu est ensuite coulé en boîtes puis refroidi pour obtenir un milieu solide. 

Gélose

Columbia + 5 % de sang de cheval Gélose Columbia -39g Eau distillée -1l Matériel et Méthodes 24 Dissoudre à chaud la gélose dans l’eau distillée puis autoclaver à 121°C pendant 15 minutes. Ajouter 5% de sang de cheval puis couler le milieu ainsi préparé en boîtes de Pétri.

Gélose Wilkins

Chalgren + sang de cheval : Wilkins Chalgren 43g Eau distillée 1L Dissoudre le mélange obtenu à chaud puis autoclaver à 121°C pendant 15minutes. Ajouter 5% de sang de cheval puis couler le milieu ainsi obtenu en boîtes de Pétri. II-2 / Milieux pour la conservation des souches:

Milieu MGY : Préparation

 – Lait écrémé 10 g – Glucose 1g – Extrait de levure 0,5g – Glycérol . 10ml – Eau distillée . 100ml Mélanger et autoclaver pendant 15mn. II-2-2 / BCC + glycérol à 25 % + lactose à 6 % – Bouillon cœur – cervelle en poudre . 3,7g – Lactose . 6g – Glycerol 25ml – Eau distillée 10ml Dissoudre la poudre à chaud dans l’eau distillée stérile et le mélange est autoclavé à 121°C pendant 15 mn.