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Matériel biologique

Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) (Fig. 7) communément appelée mouche du vinaigre, appartient à la famille des drosophilidae. Son génome entièrement séquencé (Adams, 2000), sa facilité et son faible coût d’élevage, son cycle de reproduction court (10 à 12 jours à 25° C), sa petite taille (2-3 mm) ainsi que la disponibilité de nombreux outils génétiques et moléculaires font de cette mouche un modèle d’étude privilégié en recherche scientifique et médicale.
Dès le début du 20ème siècle, Thomas Hunt Morgan a été le premier à comprendre l’importance de la drosophile en tant que modèle animal ; ce qui lui a valu en 1933, le prix Nobel de physiologie/médecine pour ses recherches sur la relation entre le chromosome et l’hérédité. L’importance de la drosophile pour la santé humaine a été reconnue plus récemment par l’attribution du prix Nobel de médecine en 1995 pour les travaux sur la génétique du développement embryonnaire. Le dernier prix Nobel a été obtenu en 2017 par Jeffrey C. Hall et ses collaborateurs pour leurs études sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent le rythme circadien.
Dans le domaine des neurosciences, la drosophile a été largement étudiée, puisque malgré sa petite taille, son système nerveux central (100.000 neurones) semble fonctionner selon des mécanismes moléculaires identiques à ceux des mammifères y compris l’homme.
Le cycle de vie de D. melanogaster comprend 4 stades : embryonnaire, larvaire, pupal et adulte. À 25°C, il ne faut que 10 jours à la drosophile pour passer de stade œuf à adulte. La femelle peut pondre jusqu’à 400 œufs de 0,5 mm de taille dans un lieu de ponte favorable. Au bout de 24 heures après la ponte, les œufs donnent naissance aux larves du premier stade.
Le stade larvaire se compose de trois stades (L1, L2 et L3 d’une durée respective de 24 h, 24 h et 48 h). Après 4 jours d’alimentation vorace, la larve du 3ème stade s’encapsule dans un puparium où se déroule la métamorphose.
La période pupale dure 3 jours et demi environ, au terme desquels, les structures adultes sont mises en place (Fig. 8). L’adulte de D. melanogaster émerge par l’opercule du puparium et devient mature sexuellement.
Les mouches utilisées pour nos expériences appartiennent à la souche Canton S et sont élevées au laboratoire sur un milieu nutritif standard (voir annexe 3), sous un cycle jour-nuit de 12 h, une température de 25°C et une humidité́relative de 70%. Afin d’éviter le problème de compétition larvaire, les mouches sont transférées dans des tubes contenant un nouveau milieu tous les 3 jours.

Présentation de l’insecticide et traitement

Le NeemAzal-T/S est une formulation commerciale d’un insecticide d’origine naturelle dont la matière active est l’azadirachtine (1% azadirachtine A ; Émulsion Concentrée (EC) ; firme : trifolio-M GmbH, Lahnau, Allemagne) issue d’une extraction huileuse des graines de l’arbre de Neem, Azadirachta indica. L’azadirachtine a été dissous dans l’acétone et administré par application topique sur des larves de D. melanogaster au début du troisième stade larvaire (L3) à deux doses, 0,28 µg et 0,67 µg correspondant respectivement aux DL25 et DL50 des stades immatures (Bezzar-Bendjazia et al., 2016).
Toutes les expériences ont été réalisées sur des adules ayant survécu au traitement larvaire. Les insectes témoins ont été exposés uniquement au solvant (1 µl d’acétone) selon Bensebaa et al (2015) et toutes les mouches ont été conservées dans les mêmes conditions que celles mentionnées ci-dessus.

Étude de la fécondité et de la préférence d’oviposition

Afin d’évaluer si une exposition unique à l’azadirachtine au début de stade L3 de D. melanogaster affecte l’oviposition des femelles, nous avons étudié les performances de ponte en utilisant un test de fécondité en conditions de choix ou de non-choix du milieu de ponte.
Condition de non-choix du milieu de ponte
Trois femelles vierges âgées de 3 jours préalablement accouplées avec des mâles du même âge (Bezzar-Bendjazia et al., 2016), sont utilisées pour les tests de fécondité. Les femelles des séries témoins et traitées (azadirachtine au début de stade L3 : DL25 et DL50) ont été mises à pondre pendant 24 h dans une boîte de Petri (Ø = 65 mm) remplie de 3 ml de milieu nutritif contenant de l’azadirachtine à deux concentrations : 0,1 µg/ml ou 0,25 µg/ml (Fig. 9). Un milieu nutritif contenant de l’acétone a été utilisé comme milieu contrôle. À la fin du test, les mouches ont été retirées et le nombre d’œufs pondus sur chaque milieu a été comptabilisé.
Condition de choix du milieu de ponte
Des expériences similaires ont été réalisées afin d’étudier la préférence du site de ponte en condition de choix. Trois femelles fécondées âgées de 3 jours issues des séries témoins et traitées (DL25 et DL50) ont été mises à pondre pendant 24h dans un dispositif de ponte (pondoir) à choix binaire contenant deux boîtes de Petri l’une remplie de milieu contrôle (acétone) et l’autre d’un milieu traité (azadirachtine à 0,1 µg/ml ou 0,25 µg/ml) (Fig. 10). Après 24h, la préférence de ponte a été évaluée en comptant le nombre d’œufs pondus sur chaque milieu.
Les tests réalisés dans les deux conditions (choix ou non-choix) ont été effectués sur trois générations successives (génération parentale, F1 et F2), avec 12 répétitions pour chaque milieu, chaque condition et chaque génération. Aucune mortalité des femelles n’a été enregistrée au cours de nos expérimentations et ce durant la durée d’exposition (24h).
À l’issue du dénombrement des œufs déposés sur chaque pondoir, un indice de préférence d’oviposition (OPI) est calculé comme suit : (nombre d’œufs pondus sur le milieu d’azadirachtine – nombre d’œufs pondus sur le milieu témoin) / nombre total d’œufs. Cet indice peut varier de -1 (aversion pour l’azadirachtine) à +1 (attirance envers l’azadirachtine).

Étude du développement

Afin d’évaluer l’impact d’une exposition unique à l’azadirachine des stades L3 sur le développement de D. melanogaster au cours des générations successives ; dix femelles, des séries témoins ou traitées à l’azadirachtine (DL25 et DL50), appartenant à la génération parentale et âgées de 3 jours, ont été mises à pondre pendant 8h dans un dispositif de ponte contenant deux pondoirs (boite de Petri) remplis de milieu témoin (acétone) ou traité (azadirachtine : 0,1 ou 0,25 µg/ml).
À l’issu du test, les mouches ont été retirées et un pool de 100 œufs, pour chaque condition, a été transféré dans une nouvelle boîte de Petri contenant le même milieu. L’impact sur le développement de chaque stade (larve, pupe et adulte) a été évalué, en comptabilisant le nombre de larves de troisième stade, de pupes et d’imagos (Fig. 11). Le sex-ratio exprimé par le nombre de mâles divisé par le nombre total d’insectes émergés a également été évalué.
Les mouches de la génération parentale ont été croisées et les mêmes expérimentations ont été répétées pour la génération suivante (non exposée : F1), en comptabilisant les mêmes paramètres.
La durée de développement pour chaque stade a été enregistrée pour les deux générations testées et exprimées par le T50 (temps en heures, lorsque 50% de la population a atteint le stade larvaire, pupal ou imaginal dans les flacons). Un stéréomicroscope à zoom (Leica Z16 APO) a été utilisé afin de détecter d’éventuelles distorsions morphologiques et des photographies ont été prises.
Les résultats ont été comparés en utilisant un facteur (FNO) décrivant le nombre final d’organismes en comparaison aux témoins (Ventrella et al., 2016). Le FNO a été calculé comme suit : FNO= (T−CC) × 100
T = nombre final d’organismes sur le milieu traité.
C = nombre final d’organismes sur le milieu témoin.
Des valeurs positives de FNO révèlent un nombre d’organismes plus élevé sur le milieu traité, alors que des valeurs négatives signifient que le nombre d’individus est plus élevé sur le milieu témoin.

Analyse de survie des adultes

Une analyse de survie a été réalisée afin d’évaluer les effets de l’unique exposition au stade larvaire sur la longévité des adultes et ce sur deux générations successives (P : exposés, F : non exposés) en utilisant le protocole de Linford et al. (2013).
Les adultes nouvellement émergés ayant survécu au traitement préalable au stade larvaire (DL25 et DL50) ont été séparés selon leurs sexes dans des flacons en plastique (15 mâles et 15 femelles par flacon) contenant 3ml de milieu standard. Les insectes sont maintenus à 25°C (photopériode : 12 : 12h) et transférés dans un nouveau flacon tous les 2 jours. Les mouches ont été gardées en observation pendant 15 jours au cours desquels la mortalité a été évaluée toutes les 24h (Fig. 12). Une série témoin a été réalisée en parallèle dans les mêmes conditions. Dix répétitions ont été effectuées pour chaque dose, sexe et génération.

Étude de l’activité locomotrice des adultes

Dans le but d’évaluer les effets de l’azadirachtine administré au début du stade L3 de D. melanogaster sur l’activité locomotrice des adultes survivants au traitement, les mouches ont été testées selon le protocole comportementale de géotaxie négative réalisé sous lumière inactinique rouge (Ali et al., 2011).
Dix mouches (mâles ou femelles séparément) âgées de trois jours des séries témoins et traitées (DL25 et DL50) ont été placées, sans anesthésie préalable, dans un tube en plastique vide (18 cm de long x 2 cm de diamètre). Après 15 minutes sous lumière inactinique, les tubes sont doucement tapés durant 3 secondes de manière à ce que toutes les mouches se retrouvent au fond du tube. Le nombre de drosophiles capables d’atteindre le haut du tube en 15 secondes est comptabilisé. Cinq répétitions à 5 min d’intervalle ont été effectuées pour chaque dose, sexe et génération (P et F1) pour une durée totale de 25 min. Les résultats sont présentés en pourcentage de mouches ayant atteint le haut du tube (1cm avant le bouchon) (Fig. 13).

Étude de la perception olfactive des adultes : Olfactomètre en Y

Afin d’évaluer l’impact de l’expérience pré-imaginale à l’azadirachtine sur le choix olfactif (attirance/répulsion) des mouches adultes, nous avons utilisé un labyrinthe en forme de Y présentant un choix olfactif binaire.
Les adultes (10 mâles, 10 femelles), âgés de 3 jours, des séries témoins et traitées (DL25 et DL50) séparés selon leur sexe, sont mis à jeûner 17 heures avant le test dans un tube contenant un papier humidifié, et maintenus à 25° C.
On dépose sur un papier filtre (Whatmann, N° 41), 50μl de solution d’azadirachtine à 0,25μg/ml, et sur un autre papier filtre 50μl d’acétone (utilisé comme témoin). On laisse évaporer et on humidifie les papiers filtre avec 1ml d’eau distillée.
On découpe alors les zones de façon à obtenir un carré mesurant 5 x 5 mm, on place ces papiers filtre dans deux tubes d’élevage en plastique (longueur : 9,3 cm, Ø 2,2cm).
Les tubes sont reliés entre eux par un tube en Y (Fig. 14). Afin de piéger les mouches qui entrent dans chaque tube, le tube en Y est relié à un cône sectionné, traversant un bouchon de mousse. La troisième branche du tube en Y est reliée à un troisième tube, contenant les 10 adultes à tester. Figure 14. Olfactomètre en Y utilisé pour l’étude de l’orientation des mouches vers des odeurs. Les tests sont effectués sous lumière rouge afin d’éviter les stimuli visuels autant que possible (Simonnet et al., 2014). Après 2 heures, on compte le nombre de drosophiles dans chaque tube et un indice d’olfaction (IO) est calculé comme suit :
IO = (nombre de drosophiles dans le tube contenant l’azadirachtine – nombre de drosophiles dans le tube contenant l’acétone) / nombre total de mouches utilisées.

Test de sensibilité gustative (Proboscis Extension Response : PER)

Nous avons utilisé une approche comportementale appelée extension du proboscis (PER) afin de vérifier la détection de l’azadirachtine par les mouches. 30 mâles et femelles, âgés de 3 jours, préalablement traités (DL25 et DL50) au stade L3 ainsi qu’une série témoin (tubes ne contenant que du papier filtre imbibé d’eau distillée) sont mis à jeûner 20 h avant le test et maintenus à 25°C).
Deux heures avant le test, les mouches sont anesthésiées en les plaçant dans un tube de verre plongé dans de la glace (1-2 minutes) puis disposées sur du patafix (UHU stick), et immobilisées sur le dos grâce à une bandelette de scotch placée sur le thorax (Fig.15).
Le test consiste à toucher le proboscis avec une goutte de la substance à tester. En cas de réponse positive à la substance testée, la mouche étendra son proboscis pour se nourrir (Fougeron et al., 2011). Afin d’éviter les faux positifs, avant chaque stimulation, l’insecte est stimulé avec de l’eau. En cas de réponse positive, la mouche ne sera pas testée. Si la mouche n’a aucune réaction, on teste alors une goutte de saccharose (100 mM) afin de vérifier que l’extension du proboscis peut se faire correctement. Si aucune extension n’est visible, la mouche ne sera pas testée.
Différentes concentrations d’azadirachtine ont été testées (0,1 μg/ml, 0,25μg/ml, 1μg/ml, 10 μg/ml et 100 μg/ml). Les réponses comportementales observées sont l’extension du proboscis (PER : proboscis étendu pendant 5 s) ou l’absence de réponse.

Étude électrophysiologique

Afin d’évaluer la sensibilité des mouches préalablement traitées (DL25 et DL50) à l’azadirachtine au début du stade L3 vis-à-vis de cette molécule ; des enregistrements électrophysiologiques ont été réalisés sur des femelles âgées de 3 à 5 jours ayant survécu au traitement larvaire. Les expériences consistent à coiffer l’extrémité d’une sensille gustative avec un capillaire en verre contenant une solution stimulante et un électrolyte pendant 2 s.
Après avoir été anesthésiée dans un tube de verre plongé dans de la glace pilée (1 à 2 min), une mouche est fixée sur un support malléable (Patafix UHU stick, ®) et immobilisée avec 2-3 bandelettes de papier adhésif (Scotch crystal) de 0,2-0,5 mm x 1 cm, et placée de manière à exposer les sensilles gustatives du proboscis (Fig. 16). Une électrode de référence, constituée d’un fil d’argent placée contre la mouche et mise en contact avec celle-ci à l’aide d’une goutte de gel d’électrocardiographie (Redux Gel, Parker Laboratories, Fairfields NJ, USA).
La mouche fixée est ensuite amenée sous un microscope (Leica MZ16), et correctement orientée de façon à ce que les sensilles sur le proboscis soit accessible à la stimulation (Fig. 16) Pour la stimulation, nous avons utilisé des capillaires en verre borosilicaté (taille de la pointe d’environ 10 µm ; Harvard Apparatus LTD, EdenBridge, UK), remplis de la solution de stimulation. Cette électrode est connectée à un amplificateur de goût (TastePROBE DT-02)
(Marion-Poll & Van der Pers, 1996) qui déclenche au contact, un enregistrement de 2 secondes avec une carte d’acquisition de données 16 bits (DT9803, Data Translation, USA) échantillonnant les données à 10 kHz, sous le contrôle d’un programme personnalisé dbWave (Marion-Poll, 1996). Les données ont ensuite été amplifiées (×500) et filtrées (10-2800 Hz) avec un amplificateur CyberAmp 320 (Axon Instruments, USA).
Les solutions stimulantes utilisées sont dissoutes dans de l’eau distillée contenant du tricholinecitrate à 30 mM (TCC ; Sigma-Aldrich, France), qui est un électrolyte inhibant l’activité de la cellule à l’eau (Wieczorek & Wolff, 1989). Les solutions testées sont : L’azadirachtine (0,1μg/ml, 0,25μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml), la caféine (10mM) et le saccharose (30mM). Le TCC à 30mM a été utilisé comme contrôle.
Figure 16. Dispositif d’électrophysiologie et étapes d’enregistrements électrophysiologiques à partir de la stimulation d’une sensille gustative du proboscis chez D. melanogaster.
(A) : Poste d’électrophysiologie de gustation comprenant une loupe, un éclairage par lumière froide, un système d’amplification et d’acquisition de données et la préparation placée sur un plot magnétique, posé sur un bras articulé permettant de changer son orientation. (B) : Vue d’ensemble de la mouche immobilisée par des bandelettes de papier adhésif transparent. (C) : Vue du proboscis bien ouvert afin d’accéder facilement aux sensilles gustatives. (D) : Vue d’ensemble des sensilles. (E) : Procédure de stimulation d’une sensille : Le proboscis est maintenu immobile et la position des sensilles est identifiée. Un capillaire de verre contenant la solution stimulante et relié à un amplificateur par un fil d’argent est approché sous contrôle visuel grâce à un micromanipulateur afin de coiffer la sensille choisie. (F) : Exemple de type d’enregistrement.. La trace du haut représente le signal enregistré pendant 2 s.

Tests de consommation alimentaire (MultiCAFE : Multi Capillary Feeding)

Pour l’estimation de la quantité de liquide consommé, un test de capillaires multiples (MultiCAFE) a été réalisé. 32 adultes mâles et femelles, âgés de 3 jours, ayant survécu au traitement (DL25 et DL50) larvaire, sont séparés selon leur sexe, et mis à jeûner, dans des tubes contenant un coton humidifié, pendant 20 à 22 h (Fig. 17).

Table des matières

1 Introduction
1.1 Utilisations intensives de pesticides à large spectre
1.2 Les biopesticides
1.3 L’arbre de Neem
1.4 Toxicité et risque écotoxicologique de l’azadirachtine
1.5 Potentiel insecticide de l’azadirachtine
Effets régulateurs de croissance
Effets sur le système nerveux
Effets sur la reproduction
Effets moléculaires
Effets anti-appétant
1.6 Le système chimiosensoriel et locomoteur comme cible potentielle des pesticides 11
1.7 Le système olfactif chez D. melanogaster
1.8 Le système gustatif chez D. melanogaster
L’architecture du système gustatif
Les sensilles gustatives du proboscis
La structure des récepteurs gustatifs (GR)
1.9 Intérêt de l’étude
2 Matériel et méthodes
2.1 Matériel biologique
2.2 Présentation de l’insecticide et traitement
2.3 Étude de la fécondité et de la préférence d’oviposition
Condition de non-choix du milieu de ponte
Condition de choix du milieu de ponte
2.4 Étude du développement
2.5 Analyse de survie des adultes
2.6 Étude de l’activité locomotrice des adultes
2.7 Étude de la perception olfactive des adultes : Olfactomètre en Y
2.8 Test de sensibilité gustative (Proboscis Extension Response : PER)
2.9 Étude électrophysiologique
2.10 Tests de consommation alimentaire (MultiCAFE : Multi Capillary Feeding)
2.11 Analyses statistiques
3 Résultats
3.1 Effets sur la fécondité et la préférence d’oviposition
3.2 Effets sur le développement
3.3 Analyse de la survie des adultes
3.4 Effets sur l’activité locomotrice des adultes
3.5 Effets sur l’orientation à distance vers un substrat traité à l’azadirachtine
3.6 Effets sur la perception gustative
3.7 Effets sur les réponses électrophysiologiques des adultes
3.8 Effets sur la consommation alimentaire
4 Discussion
4.1 Effets sur la fécondité et le choix d’oviposition
4.2 Effets sur le développement et la survie des adultes
4.3 Effets sur la perception olfactive et gustative et le comportement locomoteur
5 Conclusion et perspectives
6 Résumés
6.1 Résumé
6.2 Abstract
6.3 ملخص
7 Références bibliographiques
8 Annexes
8.1 Annexe 1. Production scientifique
8.2 Annexe 2. Les molécules testées
8.3 Annexe 3. Composition du milieu axénique utilisé pour l’élevage de Drosophila melanogaster.

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