DÉVELOPPEMENT DES METHODES D’ANALYSE CIBLEE

Au travers de la littérature, nous avons pu constater la difficulté de disposer d’une méthode « universelle » pour l’analyse d’une large gamme de molécules aux propriétés physico- chimiques très variées. Chacune des étapes analytiques présente des risques d’être discriminante et donc d’obtenir une information finale qui ne reflète pas totalement la contamination réelle d’un échantillon, ce qui est l’objectif ultime de toute méthode se voulant globale. La complexité de cette tâche est, à l’heure actuelle, si importante que l’on a conscience que l’utilisation d’une méthode unique permettrait seulement de s’approcher de cette information mais ne pourra être exhaustive et comportera inévitablement des limites. Le but du travail réalisé est de réduire au maximum ces limites. La spectrométrie de masse haute résolution, permettant de détecter un très grand nombre de biotoxines marines malgré la grande diversité de leurs propriétés physico-chimiques, présente un atout majeur. Cependant compte tenu de la complexité des matrices étudiées et du nombre important de molécules à analyser, le traitement des données générées après analyse peut s’avérer très complexe en l’absence de séparation chromatographique préalable à la détection en masse. Ainsi, afin de mettre en place une approche non-ciblée la plus efficiente possible, il est indispensable de mettre au point une ou plusieurs méthodes de séparation chromatographique. Les biotoxines marines présentent une gamme de polarité très étendue allant des plus hydrophiles (STX, TTX), relativement polaire (AD), amphiphiles (PlTX) au plus lipophiles (AO, AZA, YTX, PTX, CTX, BTX, etc). Il est difficile d’avoir une méthode unique permettant de séparer l’ensemble des molécules. De ce fait, deux conditions chromatographiques différentes basées sur deux types de colonnes C18 et HILIC ont été mises en place et seront décrites dans ce chapitre. Le développement des deux méthodes.d’analyse a été essentiellement basé sur le choix des conditions analytiques et l’évaluation des performances instrumentales. Les aspects relatifs à l’extraction des toxines n’ont pas été abordés lors de ces travaux, nous avons utilisés des protocoles existants. Par contre, nous avons fait le choix de focaliser nos efforts sur la mise en place et l’optimisation d’un workflow pour l’analyse non-ciblée qui sera traitée dans le chapitre III.

Développement de la méthode ciblée pour l’analyse des toxines lipophiles et l’acide domoïque par LC-HRMS

Toutes les solutions ont été préparées avec des produits chimiques de qualité analytique et de l’eau ultra pure (18,2 M.cm) produite par avec un système de purification d’eau Milli-Q Academic (Millipore S.A., Saint-Quentin en Yvelines, France). L’acide chlorhydrique (HCl ; 37%) et l’hydroxyde de sodium (NaOH ; 99%) ont été achetés auprès de Merck (Fontenay- sous-Bois, France). Le formiate d’ammonium (> 97%) a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, France.) L’acide formique (98-100%), l’acétonitrile (ACN ; qualité HPLC) et le méthanol (MeOH ; qualité HPLC) ont été achetés auprès de Fisher Scientific SAS (Illkirch, France). La solution d’hydroxyde d’ammonium (25%) provient de chez VWR (Fontenay-sous-Bois, France). Les solutions de calibrations d’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) pour l’analyse par LC-HRMS ont été achetées auprès de Sciex (Nieuwerkerk aan den Ijssel, Pays-Bas).

certifiées des toxines suivantes : AD, AZA1-3, PTX2, AO, DTX1 et -2, YTX, hYTX, SPX1, PnTX-G et GYM. Les étalons de PnTX-A, 13,19-didesMeC et 20-meG ont été achetées auprès de Cifga (Lugo, Espagne). PbTx-2 et 3 ont été achetés chez Abcam (Cambridge, UK). Les échantillons analysés dans le cadre de cette étude sont des moules et des huîtres non- contaminées (matrices blanches exemptes de toxines) qui ont été supplémentés afin d’obtenir les compositions en toxines désirées. Une solution mère multitoxines a été préparée dans le MeOH à partir des solutions étalons certifiées de PTX2, AZA1 à 3, AO, DTX1 et 2, PnTX-A, PnTX-G, YTX, h-YTX, SPX1, 13,19-DidesMeC. 20-meG, GYM-A et AD à des concentrations allant de 120 à 240 ng/mL selon les toxines. Cette solution mère a ensuite été diluée en série dans le MeOH pour préparer six solutions de travail (L1-L6), chacune contenant les toxines étudiées à différentes concentrations. Les solutions de travail des PbTx-2 et 3 ont été préparées séparément en utilisant une solution mère à 250 ng/mL. Ces solutions de travail ont ensuite été utilisées pour préparer les gammes en matrice avec des extraits de moules et d’huîtres blanches (non- contaminées) préalablement préparés pour atteindre les niveaux de concentration appropriés : des aliquotes de 450 µL d’extraits de coquillages sont distribués dans des vials HPLC supplémentés de 50 µL de la solution multitoxines pour chaque niveau. Ce mode opératoire permet d’avoir une charge matricielle constante de 0,09 g/mL pour toutes les solutions analysées. Les gammes en solvant ont été préparées de la même manière, en utilisant du MeOH à la place des extraits d’échantillons. Les courbes d’étalonnage pour l’évaluation des effets matrice vont de 1 à 12 ng/mL pour les AZA et les imines cycliques ; 2–24 ng/mL pour les YTX, AO, DTX et PTX2 ; 6-72 ng/mL pour l’AD.