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Le genre Lobophora

Une macroalgue commune des récifs coralliens

Parmi la diversité de macroalgues associées aux écosystèmes coralliens, les algues brunes de l’ordre des Dictyotales sont particulièrement bien représentées, avec notamment le genre Lobophora (J. Agardh, 1894), appartenant à la famille des Dictyotaceae.
Avant la généralisation en taxonomie de l’analyse génétique, le genre Lobophora comprenait seulement trois espèces décrites morphologiquement (Vieira et al. 2014). Parmi ces espèces, L. variegata (espèce type du genre) est la plus communément citée dans les travaux, mais souvent à tort en l’absence d’identification taxonomique moléculaire. L‘application des analyses génétiques au genre Lobophora a révélé une diversité cachée insoupçonnée, avec aujourd’hui une estimation de 98 à 121 espèces (entités ayant une identité génétique distincte), dont la plus grande diversité se trouve dans l’Indo-Pacifique central (Vieira et al. 2017).
Le genre Lobophora présente des morphologies très variées (Figure 2). Certaines espèces adhérent fortement au substrat et sont dites encroûtantes alors que d’autres forment des lames en éventails érigés ou tapissant le substrat, ou bien disposés en forme de petites rosettes. Les frondes peuvent être fines ou épaisses, voire même présenter un aspect cuirassé chez les formes encroûtantes.
Lobophora se retrouve dans tous les bassins océaniques, des milieux chauds-tempérés à tropicaux. Les espèces se développent sur différents types de substrat (rochers, débris de coraux morts, coraux vivants, éponges, algues…) et peuvent coloniser divers habitats depuis les petits fonds (récifs coralliens, algueraies, mangroves…) jusqu’à une profondeur de 140 m pour certaines d’entre elles (Markager & Sand-Jensen, 1992). Leur cycle de vie est mal connu et les organes reproducteurs sont rarement présents. En Nouvelle-Calédonie, comme aux Antilles (de Ruyter van Steveninck 1987), Lobophora est supposée être reproductive tout au long de l’année. Lobophora possède un taux de renouvellement des thalles élevé, avec une demi-vie d’environ 20 jours qui peut varier temporellement (de Ruyter van Steveninck & Breeman, 1987).

Un genre souvent associé aux récifs dégradés

Le genre Lobophora est une algue commune des récifs coralliens. Elle est impliquée dans les interactions algues-coraux-brouteurs et la compétition pour l’espace et la lumière avec les coraux (De Ruyter Van Steveninck et al. 1988; Coen & Tanner 1989; Diaz-Pulido et al. 2009; Rasher & Hay 2010). Cependant, dans des récifs endommagés par l’action de l’Homme ou de phénomènes naturels, ce genre peut proliférer et prendre le dessus sur des coraux affaiblis. On observe alors un changement de communauté (« phase shift ») où les macroalgues dominent sur les coraux.
Depuis les premières observations en 1973 d’une prolifération de Lobophora sur les récifs coralliens de la zone des Caraïbes (Glynn 1973), ce genre a été tristement associé à la dégradation de nombreux autres récifs dans les Antilles (e.g De Ruyter Van Steveninck et al. 1988; Nugues & Bak 2006; Slattery & Lesser 2014), mais également avec une moindre ampleur dans l’océan Pacifique (notamment la Grande Barrière Australienne, Jompa & Mccook 2002).
Cependant, la question de savoir si l’algue était la cause ou la conséquence de la dégradation des coraux n’a pas été complètement élucidée. Cause ou conséquence ont fait largement débat et il est aujourd’hui admis que les «phase shifts» sont dus essentiellement à la dégradation des coraux par une combinaison de facteurs, ce qui libère de nouvelles surfaces de colonisation propice aux algues.
En Nouvelle-Calédonie, une espèce de Lobophora présente des effets délétères sur certains coraux dans les récifs en bonne santé : Lobophora hederacea (Vieira et al. 2015). Elle est majoritairement retrouvée sur le corail Seriatopora caliendrum (Pocilloporidae), qu’elle englobe progressivement, entrainant ainsi sa mort. Il est suspecté que des mécanismes d’allélochimie sont impliqués dans ce phénomène.

Qu’en est-il des connaissances sur la chimie des Lobophora ?

Bien que le genre Dictyota soit le plus étudié parmi les Dictyotales, depuis 1982 plusieurs travaux se sont intéressés aux composés naturels de Lobophora (e.g. Gerwick & Fenical 1982a; Kubanek et al. 2003; Vieira et al. 2016). La grande majorité des études ayant eu lieu avant l’étude de la diversité spécifique et génétique de Lobophora, la plupart des molécules identifiées chez ce genre ont été attribuées (à tord, on le sait maintenant) à L. variegata. Le Tableau 1 répertorie les composés originaux isolés chez Lobophora ainsi que les bio-activités associées.
Parmi ces composés originaux (voir Figure 3), nous pouvons notamment citer les lobophorénols A, B et C isolés chez L. rosacae en 2016 (Vieira et al. 2016). Ces composés relativement apolaires sont des alcools à longues chaines carbonées polyinsaturées. Gutiérrez-Cepeda et al. (2015) ont également isolé 10 composés apolaires chez L. variegata d’Atlantique, présentant des similarités avec les lobophorénols.
Des composés algaux moins « originaux » ont également été étudiés chez Lobophora du point de vue de leurs bioactivités, principalement en santé humaine. Le groupe des polysaccharides (galactofucanes, fucanes, fucoidanes) a fait l’objet du plus grand nombre d’études, avec sept publications mettant en évidence des activités anti-oxydantes (Castro et al. 2015), anti-inflammatoires (Medeiros et al. 2008; Paiva et al. 2011; Siqueira et al. 2011; Castro et al. 2014), cytotoxiques (Queiroz et al. 2008; Castro et al. 2013), anti-angiogéniques (Castro et al. 2015) et anti-coagulantes (Medeiros et al. 2008; Castro et al. 2015). Les acides gras ont montré des activités antibactériennes, pupicides, nématicides et phytotoxiques (Manilal et al. 2012) même si tous les composés lipidiques identifiés n’ont pas été testés (Thennarasan 2015). Des composés phénoliques (Rao & Untawale 1991; Chkhikvishvili & Ramazanov 2000; Chung et al. 2003), carbonyles (Mota et al. 2006) et des pigments photosynthétiques (Hegazi 2002) ont également été décrits chez Lobophora.
Le genre Lobophora est donc une algue étudiée depuis les années 1970 ayant fait l’objet de plusieurs études, aussi bien du point de vue écologique que chimique. Bien représenté dans les récifs coralliens avec une grande diversité en espèces, aux habitats et morphologies variés, ce genre est un bon modèle pour étudier l’ensemble des métabolites spécialisés (métabolome) et ses sources de variations.

Quatre espèces choisies pour notre étude

Parmi la trentaine d’espèces de Lobophora recensées en Nouvelle-Calédonie (Vieira et al. 2014), quatre ont été sélectionnées pour notre étude et sont communément rencontrées dans le lagon de Nouvelle-Calédonie. Il s’agit de L. rosacea, L. sonderii, L. obscura et L. monticola. Une brève description de chacune d’elle est donnée ci-dessous.
• Lobophora monticola (C.W.Vieira, Payri & De Clerck)
Lobophora monticola présente des thalles en forme d’éventail à surface rugueuse, d’une couleur brune-orangée. Cette espèce vit sur les coraux branchus du genre Acropora ou Montipora : les thalles peuvent se développer en total contact avec le corail ou présenter des parties libres (seule la base de la fronde est fixée au corail, Figure 4). Lobophora monticola peut former des connections entre les branches du corail par anastomose des parties distales de plusieurs frondes (Vieira 2015). Elle se retrouve classiquement dans les lagons et sur la pente interne des récifs, dans des sites abrités.
En Nouvelle-Calédonie, cette espèce de Lobophora a été répertoriée dans la partie Sud-Est, Sud-Ouest et centre-Est du lagon de la Grande Terre ainsi qu’aux îles Loyauté.
• Lobophora rosacea (C.W.Vieira, Payri & De Clerck)
Cette espèce peut présenter deux morphologies différentes ou morphotypes dont les thalles sont très fins (80-130 µm pour la première et 110-170 µm pour la seconde (Vieira 2015)). La première morphologie présente des lames une forme d’éventail de couleur orangée. La seconde présente un arrangement des thalles en rosette de couleur brune aux reflets légèrement verts.
Lobophora rosacea peut être retrouvée nichée au sein des coraux branchus (ex : Acropora, Figure
5) ou en épiphytes d’une autre espèce de Lobophora: L. sonderii, notamment dans les champs de Sargassum. Lorsqu’elle vit en association avec les coraux, les frondes sont fixées sur les branches des coraux par la partie basale alors que les parties distales restent libres.
En Nouvelle-Calédonie, on a observé cette espèce dans les lagons Sud-Ouest et Sud-Est de la Grande Terre ainsi qu’aux îles Chesterfield.
Figure 5. Lobophora rosacea nichée à la base d’un corail branchu. La disposition en rosette des lames est bien visible (© G. Boussarie).
• Lobophora sonderii (C.W.Vieira, De Clerck & Payri) (anciennement L. nigrescens J.Agardh)
Cette espèce forme un thalle de couleur brun foncé et dense, caractérisé par la présence d’un stipe basal épais. Les frondes en lame ont une épaisseur en moyenne 2 à 2,5 fois supérieure à celle de L. rosacea (168-252 µm). On la retrouve généralement dans les algueraies à grandes algues dominées par Sargassum, sur les récifs frangeants peu profonds du littoral ou des îlots (Figure 6). Elle est fixée sur des substrats durs des fonds de dalle et sable.
En Nouvelle-Calédonie, cette espèce a une large distribution autour de la Grande-Terre jusqu’au Sud-Ouest de l’île des Pins.
• Lobophora obscura (C.W. Vieira, De Clerck & Payri) (anciennement L. crassa Z.Sun, P.-E.Lim & H.Kawai)
Cette espèce est principalement encroûtante, avec des thalles épais (184-328 µm) et rugueux d’aspect cuirassé, qui adhèrent fortement aux substrats (Figure 7). De couleur brun foncé, elle présente des iridescences grises caractéristiques. Lobophora obscura se retrouve sur les coraux morts, les débris coralliens (“bedrock”), dans les eaux peu profondes (-5 m).
Elle se retrouve en Nouvelle-Calédonie dans tout l’archipel..
Figure 7. Lobophora obscura sous sa forme encroûtante, adhérant fortement à un débris de corail mort. L’iridescence grise est bien visible (© G. Boussarie).

La métabolomique, un outil intéressant au service de l’écologie chimique des algues

Le métabolome: brève présentation

Le métabolome est l’ensemble des petites molécules organiques (50-1500 Da), appelées métabolites, contenues dans un organisme, au sein des cellules, des tissus ou des fluides corporels tels que le plasma ou l’urine. Ce terme de métabolome a été introduit dans la littérature scientifique par Oliver et al (1998). Ces petites molécules organiques sont les produits intermédiaires des réactions métaboliques catalysées par différentes enzymes et qui se produisent naturellement dans les cellules (Lankadurai et al., 2013; Kumar et al., 2016). Ainsi, suivant l’état physiologique et le stade de vie de l’organisme étudié, le pool de métabolites observé pourra varier ; le métabolisme étant un système dynamique et complexe, les molécules synthétisées par un système biologique sont en perpétuel mouvement entre différents compartiments cellulaires, dégradées, modifiées, relarguées, etc.

La métabolomique, la dernière branche des techniques « omiques »

La métabolomique permet d’étudier l’ensemble des métabolites (c’est-à-dire le métabolome) d’un organisme ou d’une partie de celui-ci, à un instant donné. C’est un domaine d’étude « omique » plutôt récent comparé à la génomique et la transcriptomique. L’intérêt d’étudier le métabolome est qu’il donne une image plus “réelle” de l’état physiologique à un instant donné de l’organisme ou du compartiment biologique étudié, en comparaison au génome ou transcriptome. On parle de « snapshot » puisqu’on obtient une image du contenu métabolomique à un moment précis, le métabolisme étant un système dynamique.
En effet, les métabolites spécialisés représentent le phénotype final de l’expression cellulaire (Kooke & Keurentjes 2011) : les gènes sont transcrits en ARNm qui codent pour des protéines qui intervenant dans différentes voies métaboliques, aboutissant ainsi à la production d’une grande variété de métabolites. Ainsi, sous l’influence de perturbations environnementales, d’autres organismes ou de mutations génétiques, la transcription des gènes pourra s’en trouver affectée et les protéines produites seront modifiées, aboutissant en la production de métabolites différents (Figure 8). Ces caractéristiques font de la métabolomique un outil de plus en plus utilisé, notamment dans les études environnementales. Le métabolome est ainsi souvent considéré comme un meilleur proxy du phénotype en comparaison aux gènes, ARNm ou protéines.
Figure 8. En aval du génome et soumis aux facteurs environnementaux, le métabolome permet une mesure directe du phénotype cellulaire à l’échelle moléculaire.
La métabolomique, couplée à la transcriptomique et la protéomique ou l’étude de l’activité d’enzymes spécifiques peut être un outil puissant pour comprendre comment un ou plusieurs métabolites donnés sont contrôlés en cas de stress (“up-regulation” ou “down-regulation”).

Un peu de technique

Il existe plusieurs approches en métabolomique (cf paragraphe suivant) mais le schéma expérimental général reste le même. La première phase consiste à mettre en place un protocole expérimental adapté à la question scientifique. S’en suit la collecte des échantillons puis leur traitement (extractions chimiques, fractionnements…) avant leur analyse. Le jeu de données complexe ainsi obtenu doit ensuite être traité grâce à des outils spécifiques (ex : XCMS) avant de pouvoir réaliser les analyses statistiques et interpréter biologiquement les résultats. Le schéma global des différentes étapes d’une étude métabolomique est présenté à la Figure 9.
Il existe trois principales approches pour étudier le métabolome (Hall 2006; Kumar et al. 2016) :
• le profilage métabolique ou “metabolite profiling,”
• l’empreinte métabolique ou “metabolic fingerprinting,”
• l’analyse ciblée.
Le profilage métabolomique est semi-quantitatif et permet l’identification de métabolites connus ou inconnus dans un organisme. La nature des moyens analytiques disponibles permet en général par ce profilage d’analyser une partie seulement des composés présents dans un échantillon, en fonction de leur polarité, de leur propriété d’ionisation, de leur localisation, etc.
L’empreinte métabolique permet d’obtenir une image qualitative de la composition en métabolites d’un organisme ou d’un échantillon à un moment donné. Grâce à des analyses non spécifiques et rapides des échantillons, l’empreinte métabolomique permet des analyses de comparaison et discrimination entre individus. Le but premier de ces analyses n’est généralement pas d’identifier les métabolites présents, à l’inverse des analyses ciblées, mais d’avoir une image globale du métabolome des organismes étudiés pour différentes questions scientifiques. Cette technique est notamment utile pour étudier la réponse métabolomique d’un organisme à un stress, tel que l’exposition à un polluant, à une pression d’herbivorie ou tout autre stresseur biotique ou abiotique. L’analyse non ciblée est souvent un précurseur du profilage métabolomique.
Enfin, les analyses ciblées visent un métabolite particulier ou un groupe de métabolites en utilisant des protocoles d’extraction spécifiques et optimisés, ainsi que des techniques de détection et séparation spécialisées. Ce type d’analyse présuppose une connaissance préalable de la chimie de l’organisme étudié, ce qui n’est pas toujours le cas.
Puisque le métabolome nous donne une image du phénotype de l’organisme étudié à un instant donné, il est important que les conditions d’étude soient le plus reproductibles possible depuis la récolte des échantillons, y compris leur conditionnement, en passant par l’extraction et jusqu’à l’analyse. Il est également important de manipuler ces échantillons le moins possible pour ne pas induire de stress et donc altérer l’analyse du métabolome qui ne sera plus le reflet de ce qu’il était in situ. L’autre difficulté de la métabolomique réside dans le fait que les métabolites sont très diversifiés, notamment chez les macroalgues. Il n’existe pas de procédure unique permettant d’analyser tous les composés chimiques en une seule méthode, mais les différentes techniques analytiques actuelles, avec leurs avantages et leurs limites, nous permettent dans une certaine mesure d’enrichir nos analyses et de parer à ces difficultés.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
1. Importance des algues dans les écosystèmes coralliens
2. Les macroalgues, un réservoir de molécules
2.1. La chimie et l’écologie chimique chez les macroalgues
2.2. Des connaissances sur l’écologie chimique des algues à renforcer
3. Le genre Lobophora
3.1. Une macroalgue commune des récifs coralliens
3.2. Un genre souvent associé aux récifs dégradés
3.3. Qu’en est-il des connaissances sur la chimie des Lobophora ? 21
3.4. Quatre espèces choisies pour notre étude
4. La métabolomique, un outil intéressant au service de l’écologie chimique des algues
4.1. Le métabolome: brève présentation
4.2. La métabolomique, la dernière branche des techniques « omiques »
4.3. Un peu de technique
4.4. Les applications de la métabolomique
4.5. La métabolomique du côté des algues
4.6. La métabolomique pour étudier le métabolome de Lobophora
Sites d’étude
Objectifs de thèse
Plan de thèse
Références
PARTIE 1. DIVERSITE CHIMIQUE DE LOBOPHORA ET POTENTIEL DE VALORISATION 
CHAPITRE 1. Caractérisation de la diversité chimique de trois espèces de Lobophora
1. Contexte de l’étude
2. Matériel & méthodes
2.1. Récoltes de Lobophora
2.2. Extraction brute
2.3. Chromatographie liquide sous vide (VLC Vacuum Liquid Chromatography)
2.4. Purification de la fraction F4 (
2.5. Purification de la fraction F4 (
2.6. Purification des fractions F3 et F4 L. monticola
2.7. SPE en phase normale des fractions F5 issues de la VLC (§ 2.3) de L. rosacea, L. monticola et L, sonderii.
2.7.1 Analyses en Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
2.7.2 Purifications des fractions issues de la SPE en phase normale
2.8. Fractionnement sur colonne de silice ouverte des nouvelles collectes de masse
3. Résultats & discussion
3.1. Purification des premières collectes de masse de L. sonderii, L. rosacea et L. monticola fractionnées en phase inverse
3.2. SPE en phase normale des fractions F5 issues de la VLC de L. rosacea, L. monticola et L. sonderii
3.3. Fractionnement en phase normale de secondes collectes de masse
3.4. Bilan sur les études chimiques entreprises sur les trois espèces de Lobophora
4. Conclusion
Figures supplémentaires
Références
CHAPITRE 2. Mise au point des tests de bioactivité sur les fractions algales 
I- Recherche de bioactivités des extraits et fractions de L. sonderii, L. rosacea et L. monticola
A. Recherche d’activités pesticides à partir d’extraits bruts issus de L. sonderii et L. monticola
1. Contexte de l’étude
2. Activité insecticide sur la mouche des fruits
2.1. Matériel & méthodes
2.2. Résultats et discussion
3. Activités attractives et répulsives
3.1. Matériel & méthodes
3.1.1. Test d’attraction
3.1.2. Test de répulsion
3.2. Résultats et discussion
3.2.1. Test d’attraction
3.2.2. Test de répulsion
4. Discussion générale
B. Recherche d’activité antifongique d’extraits bruts issus de L. sonderii et L. monticola
1. Contexte et motivation de l’étude
2. Matériel & méthodes
2.1. Biotests antifongiques par disque de diffusion
2.2. Biotest antifongique en microplaque 96 puits
3. Résultats & discussion
C. Recherche d’activité acaricide d’extraits bruts issus de L. sonderii et L. monticola
1. Contexte de l’étude
2. Matériel & méthodes
2.1. Sélection des larves
2.2. Tests d’activités sur les larves
3. Résultats & discussion
4. Conclusion générale
D. Tests antibactériens sur les fractions apolaires de L. rosacea, L. sonderii et L. monticola
1. Contexte
2. Matériel & méthodes
3. Résultats & discussion
3.1. Fractions algales actives sur S. aureus de L. monticola
3.2 Fractions algales actives sur S. aureus de L. sonderii
3.3. Fractions algales actives sur S. aureus de L. rosacea
II- Suivi temporel de la biomasse de Lobophora rosacea et Lobophora sonderii au site de Ricaudy
1. Matériel & méthodes
1.1. Méthode des photo-quadrats
1.2. Traitement des photos-quadrats
1.3. Relevé des températures
2. Résultats & discussion
2.1. Suivi de L. rosacea
2.2. Suivi de L. sonderii
Références
SYNTHESE de la partie 1
PARTIE 2. ETUDE DES SOURCES DE VARIATION DU METABOLOME DE LOBOPHORA 
CHAPITRE 3. Etude de la variation du métabolome de Lobophora : mise au point de la méthode
I- Plan d’échantillonnage pour les études sur la variation du métabolome
II- Mise au point des protocoles d’analyses métabolomiques par UHPLC-MS-QToF
1. Récolte des échantillons
2. Préparation des échantillons
3. Analyses métabolomiques par UHPLC-MS-QToF
3.1. Choix de la phase mobile
3.2. Optimisation du gradient
3.3. Dilution des échantillons
3.4. Volume d’injection
3.5. Mode d’ionisation
3.6. Choix de la phase stationnaire
3.7. Paramètres MS et schéma d’injection
3.8. Traitement des données LC-MS
4. Analyses métabolomiques par 1H-RMN
5. Analyses métabolomiques par GC-MS
6. Problème rencontré en LC-MS: contamination de certains échantillons
III- Tests statistiques
Références
CHAPITRE 4. Etude de la variation intra et inter-spécifique du métabolome de Lobophora
I- Etude de la variation intra-spécifique du métabolome
1. Contexte de l’étude
2. Matériels et méthodes
2.1. Récoltes des échantillons
2.2. Extractions, analyses métabolomiques et traitement de données
3. Résultats
3.1. Cas de Lobophora monticola : le métabolome des frondes en contact avec le corail est-il différent de celles sans contact ?
3.2. Cas de Lobophora rosacea : les différentes parties du thalle présentent-elles des étabolites différents ?
4. Discussion sur l’étude intra-spécifique du métabolome
II- Etude de la variation inter-spécifique du métabolome
Résumé
Abstract
1. Introduction
2. Results
2.1. 1H-NMR
2.2. UHPLC- QToF
2.3. GC-MS
3. Discussion
4. Conclusion
5. Experimental
5.1. Sampling
5.2. Metabolites extraction
5.3. Metabolomic analyses
5.3.1. NMR
5.3.2 UHPLC- QToF
5.3.3 GC-MS
5.3.4 Data treatment
5.4. Statistical analyses
Supplementary information
Figures complémentaires à l’article
Références
CHAPITRE 5. Variation spatio-temporelle du métabolome de Lobophora : impact de l’environnement et de l’habitat
I- Variation spatio-temporelle du métabolome de Lobophora
Résumé
Abstract
1. Introduction
2. Results 2
2.1. Temporal variation 2
2.2. Spatial variation 2
2.3. Transplantation experiments 2
3. Discussion 2
4. Methods
4.1. Sampling
4.2. Transplantations
4.3. Sample preparation
4.4. Metabolomic analyses
4.4.1. UHPLC-HRMS (QToF)
4.4.2. Data treatment and statistical analyses
4.4.3. Physico-chemical parameters
Supplementary information
II- Influence de l’habitat et du substrat sur le métabolome
1. Contexte
2. Matériel & méthodes
2.1. Les expériences de transplantations croisées
2.2. Extractions, analyses métabolomiques et traitement de données
3. Résultats
3.1. Influence de la saison sur le métabolome
3.2. Influence de l’habitat et de la durée de transplantation sur le métabolome
3.3. Marqueurs chimiques responsables de la discrimination en fonction des conditions de transplantations
3.4. Marqueurs chimiques communs entre les saisons
4. Discussion
Figure et tableau complémentaires
Références
CHAPITRE 6. Impact de l’acidification sur le métabolome de Lobophora rosacea: approches in et ex situ
Résumé
Abstract
1. Introduction
2. Methods
2.1. In situ experiment
2.2. Ex situ experiment
2.3. Metabolites extraction
2.4. Metabolomic analyses
2.5. Bioactivity test
2.6. Statistical analyses
3. Results
3.1. In situ experiment
3.2. Bioactivity assay
3.3. Ex situ experiment
3.4. Chemomarkers linked to pH condition
4. Discussion
Supplementary information
References
Synthèse de la partie 2
CONCLUSION GENERALE & PERSECTIVES 
Références
Table des illustrations
Table des tableaux
Abréviations
Diffusion scientifique

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