Etude de l’activité antiasthmatique de l’extrait RAND11 chez le cobaye

 L’asthme : du grec asthma veut dire respiration difficile (PARTHIBAN P. et coll., 2013). C’est une maladie chronique des voies respiratoires aériennes due à l’inflammation et au rétrécissement de leur calibre (ABELSON P. et coll., 2004). Elle se manifeste par une dyspnée, un sifflement, une oppression thoracique et un accès de toux fréquents pendant la nuit (PEARCE N. et coll., 2011). L’asthme fait partie des maladies responsables de morbidité mondiale. Elle peut toucher toutes les classes d’âge. D’après l’ISAAC (The International Studies in Asthma and Allergy in Childhood) et l’OMS (Organisation mondiale de la Santé), 14% des enfants et 8,6% des jeunes et adultes dans le monde présentent les symptômes de l’asthme (MARKS G. et coll., 2014). Malgré le progrès de la médecine moderne, sa prévalence pendant ces dernières années ne cesse de croitre. D’après les données épidémiologiques en 2012, 300 millions de personnes dans le monde souffrent d’asthme (WOLFF P. T. et coll., 2012). Les études épidémiologiques ont révélé que l’accroissement de la prévalence de cette maladie est dû à l’augmentation des personnes qui produisent excessivement de l’IgE et de la pollution de l’environnement (GOPUMADHAVAN S. et coll., 2005). Il est fréquent et en accroissement rapide dans les pays sous-développés (MARKS G. et coll., 2014). En Afrique, l’augmentation des personnes atteintes d’asthme passe de 94,8 millions à 119 millions entre 2000 et 2010 (ADELOYE D. et coll., 2013). A Madagascar, 8 à 12% de la population sont atteints de cette maladie (RAKOTOMIZAO J. et coll., 2009). L’asthme est divisé en 2 catégories : l’asthme extrinsèque et l’asthme intrinsèque. L’asthme extrinsèque est aussi appelé asthme allergique, il est causé par des antigènes ; tandis que l’asthme intrinsèque est d’origine génétique (SALONEN R. O., 1985). Dans le cas de l’asthme allergique, la fixation de l’allergène sur l’immunoglobine E (IgE) conduit à la libération des médiateurs inflammatoires et bronchoconstricteurs au niveau des mastocytes (BARNES P. J., 2008), comme l’histamine dont la fixation sur le récepteur de type H1 provoque la contraction des muscles lisses bronchiques (JUTEL M. et coll., 2005). L’asthme intrinsèque n’est pas d’origine allergique mais causé par des réponses immunitaires innées provoquant aussi une inflammation et une hyperréactivité bronchique (RAGOMZINGBA Z., 2013). Par ailleurs, le système nerveux autonome joue également un rôle important dans l’asthme. La stimulation du système nerveux parasympathique cholinérgique de type muscarinique provoque une bronchoconstriction. Tandis que le système sympathique, qui agit sur les récepteurs beta2 du 2 muscle lisse bronchique provoque un effet contraire et entraîne une bronchodilatation. Enfin, il existe un système non adrénergique non cholinergique excitateur (NANCe) et un système non adrénergique non cholinergique inhibiteur (NANCi). La composante excitatrice (NANCe) agit par l’intermédiaire des tachykinines, substance P (SP), et le neurokinine A (NKA) et provoque une bronchoconstriction ; tandis que la composante bronchodilatatrice ou NANCi agit par le biais de la vasointestinale peptide (VIP) et du monoxyde d’azote (NO) pour provoquer la bronchodilatation (figure 1) (WIDDICOMBE J. G., 1998). Figure 1. Régulation physiologique des voies respiratoires L’altération du système nerveux autonome est responsable de la genèse de l’asthme non allergique : la libération excessive de neuromédiateurs bronchoconstricteurs comme l’acétylcholine conduit à la contraction exagérée des muscles lisses bronchiques. D’autre part, les médiateurs inflammatoires libérés par les mastocytes provoquent l’inflammation des bronches. Ce qui entraine la diminution de leur diamètre (SALONEN R. O., 1985). Quand l’inflammation s’aggrave, les muscles lisses bronchiques deviennent hypertrophiés et les bronches sont obstruées d’une manière permanente (PATIL S. D. et coll., 2011). Les bronchodilatateurs et les anti-inflammatoires sont les principaux médicaments indiqués dans le traitement de l’asthme (RABE K. F. et SCHMIDT D. T., 2001). Les bronchodilatateurs 3 atténuent les crises en agissant au niveau du tonus bronchique. Tandis que les antiinflammatoires sont indiqués dans le cas d’inflammation bronchique. Ils suppriment les réponses inflammatoires en inhibant la libération des médiateurs inflammatoires (METHA A. et AGRAWAL B.,2008). Les agonistes beta2-adrénergiques, les anticholinergiques et les xanthines sont des bronchodilatateurs indiqués dans les crises d’asthme. Il existe des agonistes beta2-adrénergiques qui possèdent une action de courte durée comme le Salbutamol (Ventolin®), le Terbutaline (Bricanyl®) et ceux qui possèdent une longue durée d’action comme le Formotérol (Foradil®) et Salméterol (Sévérent®). L’Ipratropium bromure (Atrovent®) est un anticholinergique utilisé en cas de crise. Et enfin les xanthines inhibent la libération de la phosphodiéstérase : enzyme hydrolysant l’AMPc ; l’augmentation du taux de ce dernier provoque une bronchodilatation, par exemple la Théophylline (Dilatrane®) (BELLIA V. et coll., 2006). Les anti-inflammatoires les plus utilisés sont les corticoïdes inhalés : Beclomethasone (Qvar®), Budésonide (Pulmicort®). Les moins connus sont les anti-leucotriènes par exemple Montelukast (Singulair®) et les cromones : Cromoglycate de Sodium (Lomudal®). Ces derniers inhibent la synthèse et la libération des médiateurs de l’inflammation (NANDHA R., 2013) (figure 2). 

Préparation de l’extrait

Les feuilles de la plante utilisées dans ce travail ont été récoltées à Andasibe au mois de Novembre 2015. Elles ont été découpées en petits morceaux puis séchées à l’ombre, dans une salle aérée, à la température ambiante pendant 4 semaines. Les feuilles sèches ont été broyées à l’aide d’un broyeur à marteau électrique au LPGPC. Deux cent cinquante grammes de la poudre des feuilles obtenues ont été macérés à la température ambiante dans un mélange alcool éthylique-eau (60 :40) pendant trois jours. Le mélange a été agité 3 fois par jour pendant les 3 jours de macération. Le macérât obtenu a été filtré sur un coton hydrophile, et le filtrat a été évaporé à sec à l’aide d’un distillateur à la température de 80°C (figure 3). L’extrait sec obtenu a été codé RAND11 puis pesé pour calculer le rendement de l’extraction, selon la formule : r (%) = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙 ′𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡 ℎ𝑦𝑑𝑟𝑜𝑎𝑙𝑐𝑜𝑜𝑙𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑝𝑜𝑢𝑑𝑟𝑒 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑚𝑎𝑐é𝑟é𝑒 × 100 6 BROYAGE MACERATION Éthanol-eau (60 :40) 3 jours à la température ambiante FILTRATION Sur coton hydrophile EVAPORATION A SEC (80°C) 

Criblage phytochimique

Des tests phytochimiques ont été effectués pour déterminer les familles chimiques présentes dans l’extrait hydroalcoolique en utilisant des réactifs spécifiques. En présence de ces réactifs, la famille correspondante réagit par l’apparition de précipité ou par un changement de coloration (FONG H. H. S. et coll., 1977) (Tableau I). La proportion relative de chaque famille chimique a été exprimée en utilisant les signes suivants : + : Présence à faible concentration. ++ : Présence à moyenne concentration. +++ : Présence à forte concentration. Tableau I. Tests utilisés pour déterminer les familles chimiques présentes dans l’extrait RAND11 (FONG H. H. S. et coll., 1977). Familles chimiques Tests Réactifs Observations ALCALOÏDES DRAGENDORFF, MAYER, WAGNER Précipitation TANINS Gélatine + NaCl Précipitation verte Gélatine + FeCl3 Méthanol Précipitation bleue COMPOSES PHENOLIQUES Gélatine 1% Précipitation STEROIDES ET TRITERPENES LIEBERMAN BURCHARD Anhydride acétique + H2SO4 Coloration violette BADGET KEDDE Acide picrique Coloration rouge SALKOWSKI H2SO4 Anneau de séparation rouge FLAVONOÏDES WILL-STATER Ruban de Mg + HCl concentré Coloration rouge LEUCOANTHOCYANES BATH-SMITH HCl concentré + bain marie Coloration rouge violacée ANTHOCYANES HCl à froid Coloration rouge POLYSACCHARIDES + 3Volumes d’éthanol Trouble SUCRES REDUCTEURS Liqueur de Fehling+ Bain-marie Précipitation rouge brique COUMARINES NaOH 10% Fluorescence à l’UV SAPONINES MOUSSE HCl + Agitation Persistance d’une mousse (3cm d’épaisseur) après 30mn 9 B- TESTS PHARMACOLOGIQUES L’activité de l’extrait sur l’asthme expérimental a été étudiée chez le cochon d’inde en effectuant des tests in vivo et in vitro. Des tests in vivo ont été réalisés pour étudier l’effet de l’extrait sur la gêne respiratoire provoquée par l’histamine, et des tests in vitro sur la trachée isolée ont été effectués pour étudier son effet bronchodilatateur. 

Animaux d’expérimentation

Des cochons d’Inde mâles et femelles, âgés de 3 à 4 mois, pesant entre 250 à 300 g ont été utilisés. Ils ont été élevés à l’animalerie du LPGPC à la température de 20°C environ avec une alternance de lumière et d’obscurité de 12h/12h, et nourris avec des feuilles de graminées fraîches. 2- Etude de l’effet de RAND11 sur la gêne respiratoire provoquée par l’histamine Pour étudier l’activité de l’extrait sur la gêne respiratoire provoquée par l’histamine, le test de suffocation a été utilisé (PRACHI S. et PRIYANKA S., 2014). Un test préliminaire a été effectué pour sélectionner les animaux utilisés dans ce test. Les cobayes ont été sélectionnés suivant leur sensibilité vis-à-vis de l’histamine. Ils ont été mis à jeun pendant 12 heures, puis placés dans un dispositif en verre muni d’un couvercle et d’un trou comme conduit d’aération. Puis une solution d’histamine à 5 % a été pulvérisée dans la cloche. Les animaux qui ont présenté des signes de suffocation en moins de trois minutes ont été considérés comme sensibles à l’histamine et utilisés dans les tests (PARMAR S. et coll., 2010 ; PRACHI S. et PRIYANKA S., 2014). L’extrait a été dissout dans de l’eau distillée, ensuite les animaux sélectionnés ont été répartis en trois lots : un lot témoin et deux lots traités avec l’extrait. Les animaux du lot témoin ont reçu 10 ml/kg d’eau distillée et les animaux des 2 autres lots ont reçu respectivement 200 et 400 mg/kg d’extrait par voie orale dans un volume de 10 ml/kg (HARRIS P. N. et coll., 1952). Une heure après l’administration de l’extrait et de l’eau distillée, un cobaye de chaque lot a été placé dans le dispositif et la solution d’histamine à 5% y a été pulvérisée. Les animaux ont été laissés en contact de l’histamine pendant 5 minutes, et le temps d’apparition de la détresse respiratoire chez les animaux a été noté pendant cette période (PARTHIBAN P. et coll., 2013). La même procédure a été effectuée pour les autres cobayes de chaque lot.