Evaluation du statut en fer et de ses déterminants

 Prélèvements sanguins

Les différents dosages sont effectués à partir des prélèvements d’échantillons de sang. Ces derniers sont obtenus par ponction veineuse à l’aide d’un dispositif constitué d’un tube en polyéthylène à vide contenant un anticoagulant (héparine de lithium) à usage unique indemne de contamination métallique (ref 01.1604.400 ; Sarstedt AG et Co, Numbrecht, Germany). Deux tubes d’environ 5ml ont été prélevés et protégés de la lumière immédiatement à la fin du prélèvement avec un papier aluminium. Les échantillons sont transportés dans une glacière à 4°C jusqu’à la « voiture laboratoire » où ils sont traités. Au plus tard dans les 2 heures suivant le prélèvement, un petit volume sanguin (dans un tube) est prélevé pour la détermination du taux d’hémoglobine. Le sang residuel est centrifugé à 767 g (3200 trs/mn) pendant 12 mn à l’aide d’une Centrifugeuse EBA 20 (model 2002, Andreas, Hettich Gmbh & Co-KG, Tuttlingen, Germany) pour obtenir du plasma. Le plasma est immédiatement réparti dans 3 cryotubes stériles de 2 ml (Cryogenic vials Nalgène ; Nalge Nunc International, 75 P) et conservés dans un mini-congélateur WAECO à -20°C jusqu’au laboratoire où les échantillons sont stockés à -80°C jusqu’aux dosages.

Détermination du taux d’hémoglobine

Le taux d’hémoglobine (Hb) est déterminé avec le système HemoCue® (HemoCue AB, Ängelholm, Sweden) fonctionnant selon le principe de la photométrie. Ce système comporte une microcuvette contenant un réactif sec ( désoxycholate de sodium, nitrite de sodium, azide de sodium et flurescéine) qui au contact avec la goutte de sang. entraîne l’hémolyse des érythrocytes, ce qui libère l’hémoglobine. Le nitrite de sodium transforme l’hémoglobine en méthémoglobine qui réagit avec l’azide de sodium pour former l’azide de Mis en forme : Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,88 cm + Retrait : 2,52 cm Mis en forme : Avec puces + Niveau : 2 + Alignement : 3,15 cm + Retrait : 3,79 cm Mis en forme : Retrait : Gauche : 1,25 cm, Suspendu : 0,75 cm, Hiérarchisation + Niveau : 1 + Style de numérotation : 1, 2, 3, … + Commencer à : 1 + Alignement : Gauche + Alignement : 1,25 cm + Retrait : 1,88 cm 9 méthémoglobine. Après l’introduction de la microcuvette dans le photomètre HemoCue, la lecture du taux d’hémoglobine se fait en 15-45 secondes. • Control de qualité Le contrôle de qualité est réalisé avec des solutions de contrôles à 3 niveaux (bas, normal et haut) (Eurotrol B.V, Keplerlaan 20, The Netherlands). Par ailleurs, l’appareil HemoCue comporte un système de qualité interne ou autocontrôle et il vérifie automatiquement son système optique dès la mise sous tension. • Définition de l’anémie (WHO, 2008) 1. Chez les femmes enceintes • Non anémiées : Hb ≥ 110 g/L • Anémie marginale : 100 ≤ Hb <109 g/L • Anémie modérée : 70 ≤ Hb < 99 g/L • Anémie sévère : Hb < 70 g/L 2. Chez les femmes non enceintes • Non anémiées ≥ 120 g/L • Anémie marginal : 110 ≤ Hb <119 g/L • Anémie modérée : 70 ≤ Hb <109 g/L • Anémie sévère : Hb < 70 g/L

Dosage de la concentration de la ferritine

Plasmatique o•Principe Le principe de dosage associe la méthode immuno-enzymatique par sandwich en une étape à une détection finale en fluorescence (ELFA : Enzyme Linked Fluorescent Assay). • Appareillage et réactifs La concentration de la ferritine plasmatique est déterminée avec un analyseur automatique Mini Vidas (Biomérieux SA, Lyon, France). Le coffret de dosage Vidas Ferritin (Biomérieux SA, Lyon, France) contient 60 cartouches, 60 cônes, un flacon de 2 ml du contrôle FER (C1), un flacon de 2 ml du standard (S1), une solution Tampon de dilution FER, une carte MLE (contenant les données usines nécessaires à la calibration du test) et une notice. Chaque cartouche est composée de 10 puits. Les différents réactifs nécessaires à l’analyse sont prêts à l’emploi et sont contenus dans les huit puits intermédiaires. Les cônes Mis en forme : Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,89 cm + Retrait : 2,52 cm Mis en forme : Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,89 cm + Retrait : 2,52 cm Mis en forme : Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 2,52 cm + Retrait : 3,16 cm Mis en forme : Avec puces + Niveau : 2 + Alignement : 3,79 cm + Retrait : 4,42 cm Mis en forme : Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 2,52 cm + Retrait : 3,16 cm Mis en forme : Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 3,75 cm + Retrait : 4,38 cm Mis en forme : Retrait : Gauche : 2,5 cm, Suspendu : 0,5 cm, Avec puces + Niveau : 2 + Alignement : 1,9 cm + Retrait : 2,54 cm Mis en forme : Retrait : Gauche : 2,37 cm, Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,89 cm + Retrait : 2,52 cm 10 sont sensibilisés par des immunoglobulines monoclonales de souris anti-Ferritine. Le cône à usage unique sert à la fois de phase solide et de système de pipetage. • Mode opératoire Cent microlitre (100 µl) de plasma sont introduits à l’aide d’une pipette automatique dans le puits échantillon de la cartouche (1er puits). Toutes les étapes du test, constituées de successions de cycles d’aspiration et de refoulement du milieu réactionnel, sont réalisées automatiquement par le Mini Vidas. Lors de l’étape finale de révélation, le substrat (4- Méthyl-ombelliferylphosphate) est aspiré puis refoulé dans le cône ; l’e nzyme du conjugué catalyse la réaction d’hydrolyse de ce substrat en un produit (4-Méthyl-ombelliferone) dont la fluorescence émise est mesurée à 450 n m. La valeur du s ignal de fluorescence est proportionnelle à la concentration de l’antigène présent dans l’échantillon. A la fin du test, les résultats sont calculés automatiquement par l’appareil par rapport à une courbe de calibration mémorisée. • Control de qualité La qualité du dosage a été vérifiée par le contrôle FER C1 (1×2 ml, Réf.30411 Biomérieux) qui permet de vérifier l’absence d’altération des réactifs. Le contrôle de la qualité interne des mesures à été effectué à l’aide d’un pool de plasma interne. L’appareil est calibré tous les 14 jours et a l’ouverture d’un nouveau lot de coffret. • Définition des seuils du statut en fer à partir de la concentration de la ferritine (FP) (WHO, 2011 ; WHO et CDC, 2004) 1. Carence en fer : FP < 12 µg/L 2. Déficit des réserves martiales : 12 µg/L ≤ FP < 15 µg/L 3. Surcharge en fer : FP > 150 µg/L • Définition de l’anémie ferriprive L’anémie ferriprive est définie à partir des valeurs d’hémoglobine (Hb) et de la ferritine plasmatique (FP). Ainsi les seuils suivants sont retenus : • Chez les femmes non enceintes : Hb < 120 g/L, FP < 12 µg/L • Chez les femmes enceintes : Hb < 110 g/L, FP < 12 µg/L Mis en forme : Retrait : Gauche : 2,5 cm, Suspendu : 0,5 cm, Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,88 cm + Retrait : 2,52 cm Mis en forme : Retrait : Gauche : 2,37 cm, Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,88 cm + Retrait : 2,52 cm Mis en forme : Retrait : Gauche : 2,37 cm, Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,88 cm + Retrait : 2,52 cm Mis en forme : Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 2,52 cm + Retrait : 3,15 cm Mis en forme : Retrait : Gauche : 2,37 cm, Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 1,88 cm + Retrait : 2,52 cm Mis en forme : Retrait : Gauche : 2,62 cm, Avec puces + Niveau : 1 + Alignement : 3,13 cm + Retrait : 3,77 cm

Dosages de la Protéine

C-Réactive et de l’alpha-1 Acide Glycoprotéine

 Dosage de la Protéine

C-Réactive • Principe La protéine C-réactive (CRP) plasmatique contenue dans l’échantillon provoque une agglutination des particules de latex couvertes d’anticorps anti-protéine C-réactive humaine. L’agglutination des particules de latex est proportionnelle à la concentration en CRP et peut être quantifiée par turbidimétrie. • Appareillage et réactifs L’appareil est un analyseur automatique Biosystems A15 (BioSystems S.A, Costa Brava 30, Barcelona, Spain) piloté par un ordinateur. La Protéine C-Réactive est dosée par un kit (Réf 13921, Biosystems) contenant les réactifs A (un tampon de glycine à 0,1 mol/L, pH 8,6 ; 2×16 ml) et B (suspension de particules de latex sensibilisées avec les anticorps anti CRP humaine ; 2×4 ml) et un standard (1×1 ml) reconstitué avec de l’eau distillée. • Mode opératoire Les mesures sont effectuées automatiquement par l’analyseur A15. Cent microlitre (100 μl) d’échantillon de plasma sont introduits dans une cupule disposée sur le plateau échantillons de l’appareil. Le mélange des réactifs A (16 ml) et B (4 ml) est disposé sur le plateau réservé aux réactifs et le contrôle de qualité des mesures est effectué avant le dosage des échantillons. Au cours de la réaction, 3 μl de plasma sont prélevés par l’analyseur qui effectue automatiquement le mélange avec 440 μl de réactif. La CRP de l’échantillon réagit avec les anticorps anti-CRP et conduit à l a formation de complexes antigène-anticorps entraînant une agglutination qui est mesurée par turbidimétrie. • Contrôle de qualité La qualité du dosage est vérifiée à l’aide de sérums Contrôle Rhumatoïde niveaux I (3×1 ml, Réf. 31213, BioSystems) et II (3×1 ml, Réf. 31214, BioSystems). Le contrôle de la qualité interne des mesures à été effectué à l’aide d’un pool de plasma interne. Les mesures sont validées lorsque les valeurs des différents contrôles sont dans les limites admises (± 2 écarts type).